黄芩苷与野黄芩苷抑制幽门螺杆菌脲酶作用及其机理研究

摘要

目的:
　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染与消化性溃疡、胃炎、甚至胃癌等疾病的产生发展密切相关。当前，治疗H.pylori感染的药物主要以抗生素为主，但日益凸显的H.pylori耐药问题、胃肠道菌群失调及不良反应等问题，让各国研究者从未停止寻找安全有效的抗H.pylori药物的研发步伐。由于脲酶为H.pylori的重要定植因子与致病因子，基于H.pylori脲酶抑制研发抗H.pylori药物，为当前国际上探求治疗H.pylori感染主要药物的一种有效途径。
　　前期对植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的两个主要活性成分——黄芩苷(Baicalin)与野黄芩苷(Scutellarin)的研究中发现，它们具有良好的体外抑制洋刀豆脲酶作用，而且，野黄芩苷抑制效果比黄芩苷强。由于H.pylori脲酶不同于洋刀豆脲酶，其与疾病相关，因此，本研究从前期以植物性脲酶为工具酶的研究，转向与疾病相关的脲酶—H.pylori脲酶为切入点，应用酶学方法，探讨黄芩苷与野黄芩苷抑制H.pylori脲酶活性的相关作用机理。本研究将阐明黄芩苷与野黄芩苷抑制H.pylori脲酶的作用机理，将有助阐明黄芩治疗H.pylori感染相关胃肠道疾病应用的药效物质基础;同时可为在研发用于治疗H.pylori感染的新型脲酶抑制剂方面，提供基源于中药的新的先导化合物、研究资料与思路。
　　方法:
　　1.幽门螺杆菌脲酶的提取及活性测定:通过Berthelot比色法（靛酚蓝显色法），以洋刀豆脲酶活性作标准对照，对H.pylori酶活性进行测定。
　　2.黄芩苷与野黄芩苷抑制H.pylori脲酶活性作用试验:通过半数抑制浓度实验，以乙酰氧肟酸(acetohydroxmic acid，AHA)为阳性药，探讨黄芩苷与野黄芩苷对H.pylori脲酶活性的抑制程度。
　　3.H.pylori脲酶动力学研究试验:根据Lineweaver-Burk plot及其方程，求得动力学参数vmax及米氏常数KM;通过两种不同的方法，即Dixon plot和Lineweaver-Burkplot的二次作图法，分别求出抑制常数Ki值。此外，运用Dixon作图法及Lineweaver-Burk plot的二次作图法，进一步确证黄芩苷/野黄芩抑制H.pylori脲酶的作用类型。
　　4.黄芩苷与野黄芩苷对H.pylori脲酶抑制位点分析试验:利用两类化合物，第一类为含巯基化合物，包括二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、半胱氨酸(cysteine，Cys));第二类为脲酶活性中心抑制剂，包括硼酸(boric acid，BO)与氟化钠(sodium fluoride，NaF)，这两类化合物与脲酶活性部位的结合的异质性，通过脲酶-巯基保护试验、脲酶的再活化试验，初步探讨黄芩苷与野黄芩苷抑制幽门螺杆菌脲酶的作用位点。
　　5.H.pylori脲酶分子对接研究:通过分子对接运行软件Auto-Dock version4.0，分别对黄芩苷、野黄芩苷，与幽门螺杆菌脲酶的相互作用情况进行模拟，进一小验证抑制位点。
　　结果:
　　1.黄芩苷与野黄芩苷抑制H.pylori脲酶活性作用研究
　　黄芩苷与野黄芩苷对H.pylori脲酶的半数抑制浓度(IC50)分别为0.82±0.07 mM与0.47±0.04 mM，为乙酰氧肟酸AHA(IC50=0.14±0.05 mM)的半数抑制率的6倍与3倍。表明黄芩苷与野黄芩苷抑制H.pylori脲酶活性的效力虽不及AHA强，但显示良好的体外抑制H.pylori脲酶活性。实验结果还提示，黄酮类C环上的4'-OH有助于抑制作用。
　　2.H.pylori脲酶动力学研究
　　黄芩苷与野黄芩苷，两者对H.pylori脲酶的抑制动力学均表现出米氏常数KM不变，最大反应速率vmax降低的动力学参数变化特征，表明黄芩苷与野黄芩抑制H.pylori脲酶均为非竞争性抑制类型。通过Dixon Plot作图法，求得黄芩苷与野黄芩抑制H.pylori脲酶的抑制常数Ki分别为0.14±0.01 mM与0.18±0.02 mM，提示黄芩苷对H.pylori脲酶的亲和力优于野黄芩苷对H.pylori脲酶的亲和力。。
　　3.抑制位点分析
　　(1)脲酶活性中心抑制剂（硼酸、氟化钠）对脲酶活性的保护作用极弱;而含巯基化合物（二硫苏糖醇、谷胱甘肽、半胱氨酸）能保护H.pylori脲酶，使其不受黄芩苷与野黄芩苷的抑制作用，提示黄芩苷与野黄芩苷对H.pylori脲酶的抑制位点主要在巯基部位。
　　(2)加入二硫苏糖醇，可恢复已被黄芩苷与野黄芩苷抑制的H.pylori脲酶活性，提示黄芩苷与野黄芩苷对H.pylori脲酶的抑制作用为可逆反应。
　　4.分子对接研究
　　分子对接研究显示，黄芩苷与野黄芩苷以氢键的形式与H.pylori脲酶flap区域上的必需基团结合，特别是Cys-321，影响脲酶活性构象，从而抑制H.pylori脲酶活性。
　　结论:
　　黄芩苷与野黄芩苷能有效抑制H.pylori脲酶活性，且抑制作用具有浓度依赖的特点。动力学研究表明，黄芩苷与野黄芩苷以非竞争性、可逆的抑制方式对H.pylori脲酶进行抑制。抑制位点及分子对接研究表明，通过抑制H.pylori脲酶的巯基这一作用位点，黄芩苷与野黄芩苷发挥H.pylori脲酶活性抑制作用。本研究成果为从天然药物中寻找有效且安全的脲酶抑制剂，提供机理研究思路;为黄芩苷及野黄芩苷，作为脲酶抑制剂，在H.Pylori感染相关疾病上的应用开发，提供研究基础与资料。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

第一节 幽门螺杆菌研究进展

一、H．pylori简介及其危害

二、H．pylori感染的药物治疗

三、H．pylori脲酶致病机理的研究

第二节 脲酶及脲酶抑制剂研究进展

一、脲酶研究进展

二、脲酶抑制剂的研究概况

第三节 黄芩苷及野黄芩苷的研究进展

一、黄芩在中医药治疗H．Pylori感染中的应用

二、黄芩苷及野黄芩苷的药理研究进展

第二章 实验研究

第一节 幽门螺杆菌的培养与脲酶的提取

一、试验材料

二、实验方法

三、结果与讨论

四、小结

第二节 黄芩苷与野黄芩苷抑制幽门螺杆菌脲酶活性作用研究

一、试验材料

二、实验方法

三、结果与讨论

四、小结

第三节 黄芩苷与野黄芩苷抑制脲酶动力学研究

一、试验材料

二、实验方法

三、结果与讨论

四、小结

第四节 黄芩苷与野黄芩苷对脲酶的抑制位点研究

一、试验材料

二、实验方法

三、结果与讨论

四、小结

第五节 黄芩苷与野黄芩苷抑制脲酶分子对接研究

一、分子对接方法

三、结果与讨论

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢