运用点击化学法合成18F标记的靶向肿瘤多肽

摘要

正电子发射断层显像(Positron emission tomography，PET)是目前最先进的影像学检查技术，是惟一可在活体上显示生物活动的核医学影像技术，利用正电子核素标记靶向肿瘤的分子，合成PET显像剂，可用于肿瘤成像以协助诊断与指导治疗等。
　　临床常用的显像剂是18F-氟代脱氧葡萄糖（18F-Fluorodeoxyglucose，18F-FDG），其主要反映机体的葡萄糖代谢水平。但部分肿瘤与炎症等假阳性病变的鉴别诊断欠佳，炎症病变也会表现为高摄取。
　　为增强显像剂的靶向性，学者设计了发夹状的可激活细胞穿膜肽(Activatablecell penetrating peptide，ACPP)。其发夹结构由基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)水解底物构成，可被恶性肿瘤表面高表达的MMP水解。因此ACPP到达高表达MMP肿瘤细胞表面时，发夹状结构被水解，激活的细胞穿膜肽携带放射性核素进入肿瘤细胞，即可用于肿瘤靶向PET成像。
　　除了ACPP，提高肿瘤显像特异度的方法还有受体显像。
　　PET受体显像是利用放射性核素标记的配体与高亲和力特异受体靶细胞相结合，具有配体-受体结合的高特异性和放射性检测的高敏感性两大优点。受体显像分为神经递质受体和肿瘤受体两大类，前者有多巴胺受体等，后者有雌、雄激素和生长抑素受体(Somatostatin receptors，SSTR)等。其中，SSTR是迄今研究与应用最广的肿瘤受体显像靶点。
　　SSTR是细胞膜表面的一种糖蛋白，分为5种亚型。除广泛分布于人体正常中枢神经系统及外周组织，多种肿瘤细胞表面也有表达，包括神经内分泌瘤、神经系统肿瘤和其他肿瘤（如乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌等）。肿瘤组织中的受体数量与密度比正常组织更多、更高，将放射性核素标记于生长抑素或其衍生物即可用于肿瘤显像。
　　本研究主要分为两个部分，第一部分是探讨运用点击化学法18F-FEA标记ACPP的可行性。第二部分是通过点击化学法，高效、快速合成18F-TEGay标记的生长抑素衍生物TOCA，合成18F-TOCA显像剂，以用于神经内分泌肿瘤(Neuroendocrine tumor，NET)的PET成像。
　　目的:
　　1、合成2-叠氮乙基-4-对甲苯磺酸酯，用于下一步合成18F-FEA辅基:
　　2、合成18F-FEA辅基，用于下一步的点击反应;
　　3、运用点击化学反应合成18F-ACPP;
　　4、18F-ACPP标记方法改进和失败查因;
　　5、合成18F-TEGay辅基，用于下一步的点击反应;
　　6、运用点击化学反应合成18F-TOCA，为后续的生物评价实验作准备;
　　7、优化点击反应温度，观察不同反应温度对放化产率的影响，得出最佳反应温度;
　　8、优化点击反应时间，观察不同反应时间对放化产率的影响，得出最佳反应时间。
　　方法:
　　1、溶于5mL水中的溴乙醇1.25g（10mmol）与叠氮钠0.78g（12mmol）加热至100℃搅拌反应12小时;经二氯甲烷25mL、水2×10mL萃取三次;取有机相溶液约25mL，干燥后，加入三乙胺1.417g(2ml，14mmol)，对甲苯磺酰氯1.91g(10mmol)，常温下搅拌4小时;加入甘氨酸0.15g(2mmol)，搅拌2小时;取有机相溶液，用氢氧化钠2×50mL(1mol/L)清洗两次，再次干燥;加热至40℃旋干溶剂，经硅胶柱层析法分离，收集滤过液作氢谱核磁共振检测。
　　2、18F-FEA的合成:回旋加速器采用核反应18O(p，n)18F得到[18F]氟离子富氧水溶液，将该溶液冲洗QMA柱，[18F]氟离子富集于QMA柱上，再K2.2.2./K2CO3溶液洗脱[18F]氟离子。经共沸除水，干燥的[18F]氟离子与2-叠氮乙基-4-对甲苯磺酸酯5mg(4.14nmol)的400μ L无水乙腈溶液，加热至95℃密封反应10min，85℃下缓慢氮气流辅助蒸馏15-20min，冰盐水浴冷却收集蒸馏液得到18F-FEA。
　　3、18F-ACPP的合成:依次加入并混匀抗坏血酸钠(Sodium L-ascobate，ASC)溶液100μL(1.5mol/L)、CuSO4溶液100μ L(0.45mol/L)和ACPP水溶液500μL(0.28nmol/L)。最后加入前一步合成的18F-FEA，加热至60℃密封反应15min;
　　4、(1)将ACPP加热至60℃振荡反应15min后，采用Radio-HPLC检测反应情况，验证其是否会在点击反应后发生裂解;
　　(2)点击反应时间由15min延长至75、110、145min，观察反应情况;
　　(3)浓缩反应体积，增加反应浓度，更变为ASC溶液50μL（3mol/L）、CuSO4溶液50μL(0.9mol/L)和ACPP水溶液100μL(1.4nmol/L)，反应总体积由950μL减少至450μL，观察反应情况;
　　(4)减少Cu与ASC的用量，更变为ASC溶液40μL(0.3mol/L)、CuSO4溶液20μL(0.096mol/L)和ACPP水溶液100μL(1.4nmol/L)，观察反应情况;
　　(5)加入Cu+稳定配体，更变为ASC溶液14μL(0.3mol/L)、CuSO4溶液2μL(0.09mol/L)和ACPP水溶液100μ L(1.4nmol/L)，THPTA溶液2μ L(0.45mol/L)，观察反应情况;
　　5、18F-TEGay的合成:回旋加速器采用核反应18O(p，n)18F得到[18F]氟离子富氧水溶液，将该溶液冲洗QMA柱，[18F]氟离子富集于QMA柱上，再K2.2.2./K2CO3溶液洗脱[18F]氟离子。经共沸除水，干燥的[18F]氟离子与TsOTEGay0.16mg(0.455μmol)的280μ L无水乙腈的溶液，加热至110℃密封反应15 min，得到18F-TEGay。
　　6、18F-TOCA的合成:依次加入并混匀ASC溶液100μL(1.05mol/L)、CuSO4溶液100μL(0.14mol/L)、THPTA溶液14μL(0.125mol/L)和TOCA溶液200μL(1.75nmol/L)。最后加入前一步合成的18F-TEGay，加热至60℃密封反应15min，得到产物18F-TOCA;
　　7、点击反应温度的优化:以50℃、60℃、70℃作为点击反应的温度，保持其他反应条件不变，分析反应温度对18F-TOCA放化产率的影响。
　　8、点击反应时间的优化:以15min、30min、45min、60min作为点击反应的时间，反应温度均为70℃，保持其他反应条件不变，分析反应时间对18F-TOCA放化产率的影响。
　　结果:
　　1、反应得到粗产品，经硅胶柱层析法分离，收集滤过液经氢谱核磁共振检测后确认滤过液3为2-叠氮乙基-4-对甲苯磺酸酯。
　　2、18F-FEA标记条件:[18F]氟离子与2-叠氮乙基-4-对甲苯磺酸酯加热至95℃密封反应10 min后，取少量反应液行HPLC检测，计算得到合成18F-TEGay的放化产率为98.4％。
　　3、18F-ACPP标记条件:在CuSO4/ASC的催化体系中，ACPP与18F-FEA加热至60℃密封反应15min后，取少量反应液行HPLC检测，标记失败;
　　4、(1)将ACPP加热至60℃振荡反应15min后，不会在点击反应后发生裂解;
　　(2)点击反应时间由15min延长至75、110、145min，均未标记成功;
　　(3)浓缩反应体积，增加反应浓度，仍未标记成功;
　　(4)减少Cu与ASC的用量，仍未标记成功;
　　(5)加入Cu+稳定配体THPTA，仍未标记成功;
　　5、18F-TEGay标记条件:[18F]氟离子与TsOTEGay加热至110℃密封反应15 min后，取少量反应液行HPLC检测，计算得到合成18F-TEGay的放化产率为70％。
　　6、18F-TOCA标记条件:在CuSO4/ASC的催化体系中，TOCA与18F-TEGay加热至60℃密封反应15min后，取少量反应液行HPLC检测，计算得到合成18F-TOCA的放化产率为30％，两步的总放化产率为21％。
　　7、最佳的点击反应温度:以50℃、60℃、70℃作为点击反应的温度，放化产率分别为17.9％、30.9％、19.2％，即60℃为最佳反应温度。
　　8、最佳的点击反应时间:以15min、30min、45min、60min作为点击反应的时间，放化产率分别为19.2％、17.7％、12.9％、9.6％，即15min为最佳反应时间。
　　结论:
　　本实验第一部分成功合成2-叠氮乙基-4-对甲苯磺酸酯、18F-FEA，但合成18F-ACPP不成功，经以上各种改进方法实验后，18F-FEA标记ACPP的点击反应均告失败，考虑失败原因应为ACPP多肽分子量较大且存在二级结构，均致标记难度较大。
　　实验第二部分通过两步一锅法，应用点击化学反应，合成新型的靶向神经内分泌肿瘤的生长抑素类PET显像剂;我们还探索不同反应温度和时间对点击反应的影响，得到最佳的点击化学反应的标记条件，合成的18F-TOCA具有合成时间短、放化产率高等优点。该显像剂的脂水分配系数、体外稳定性、荷瘤鼠体内分布及Micro-PET显像等实验还有待于进一步研究。该生长抑素类PET显像剂有望用于神经内分泌肿瘤的分子显像。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

第一节 一价铜催化的18F点击环加成反应

一、多肽的18F点击标记

二、多肽的18F点击标记及micro-PET成像

第二节 无铜催化的18F点击环加成反应

第三节 其他的点击化学反应

一、反电子需求的Diels-Alder反应

二、施陶丁格反应

第四节 总结

第二章 18F-ACPP的合成

第一节 绪论

第二节 材料和仪器

一、实验材料

二、实验仪器

第三节 实验方法

一、18F-氟代乙基叠氮(18F-FEA)的合成

二、18F-ACPP的合成

第五节 结果

一、18F-氟代乙基叠氮(18F-FEA)的合成

二、18F-ACPP的合成

第五节 讨论

一、18F-氟代乙基叠氮(18F-FEA)的合成

二、18F-ACPP的合成

第三章 18F-TOCA的合成与优化

第一节 绪论

第二节 材料和仪器

一、实验材料

二、实验仪器

第三节 实验方法

一、18F-TOCA的合成

二、合成条件的选择

三、标准品19F-TOCA的合成

第四节 结果

一、18F-TOCA的合成

二、合成条件选择

三、标准品19F-TOCA的合成

第六节 讨论

结语

参考文献

缩略词中英文对照表

在校期间发表论文情况

致谢