丁香酚对PC12细胞缺氧损伤的保护作用及其对NMDA受体亚基表达的影响

摘要

目的:
　　以PC12细胞缺氧损伤作为中枢神经系统缺氧损伤模型，研究丁香酚单体对于这种损伤的保护作用及其保护作用的途径可能是通过影响N-甲基-D-门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAr)的某些亚基发挥作用。从细胞形态、细胞活性、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）、钙离子浓度(calciumconcentration，[Ca2+])、突触素(synaptophysin，SYP)表达、NMDAr亚基基因及蛋白的表达等各层面，研究丁香酚发挥保护缺氧损伤作用的分子机制。鉴于缺氧损伤既是AD病的诱因之一也是AD病的结果之一，因此，对缺氧损伤的研究对于丰富AD病有一定的作用同时丁香酚的干预对于AD的治疗也是一次积极的探索。
　　方法:
　　以PC12细胞为研究对象，采用化学缺氧方法建立缺氧损伤模型。实验分为正常组、模型组、丁香酚组，计3组。正常组以无血清低糖DMEM培养基培养，模型组用10mmol/L Na2S2O4无血清低糖DMEM培养基制造缺氧损伤模型，丁香酚组用含丁香酚250nmol/L的10mmol/LNa2S2O4无血清低糖DMEM培养基处理。倒置显微镜下观察PC12细胞形态变化，CCK-8法检测各组细胞活性，流式细胞仪检测细胞凋亡率，细胞内[Ca2+]，MMP的变化，免疫组化法检测SYP的表达，RT-PCR检测NMDAr亚基Grin1、Grin2a、Grin2b、Grin2c、Grin2d、Grin3a、Grin3b的基因表达;Western-Blot方法检测NR1、NR2A、NR2B的蛋白表达。
　　结果:
　　①CCK-8活性检测显示，模型组与正常组比，细胞活性下降极显著(P＜0.01);丁香酚组与模型组比活性提高极显著（P＜0.01）而与正常组比活力降低极显著(P＜0.01)。
　　②流式细胞仪检测细胞凋亡率，模型组与正常组比，凋亡率上升显著(P＜0.05);丁香酚组与模型组比下降显著（P＜0.05），而与正常组比差异不显著。
　　③流式细胞仪检测细胞内[Ca2+]显示，模型组与正常组比细胞内[Ca2+]升高极显著(P＜0.01)。丁香酚组与模型组比，细胞[Ca2+]降低极显著（P＜0.01），而与正常组比升高极显著（P＜0.01）。
　　④流式细胞仪检测细胞MMP的变化，模型组与正常组比MMP降低极显著(P＜0.01)。丁香酚组与模型组比MMP升高极显著(P＜0.01)，而与正常组比，无显著差异。
　　⑤免疫组化检测突触素SYP表达，模型组与正常组比SYP表达减少极显著(P＜0.01)。丁香酚组与模型组比达增加极显著(P＜0.01)，而与正常组比，表达减少差异显著（P＜0.05）。
　　⑥RT-PCR检测NMDAR亚基表达情况，模型组与正常组比，Grin1表达不显著;Grin2a的表达升高显著(P＜0.05);Grin2b的表达不显著;Grin2c的表达不显著;Grin2d的表达不显著;Grin3a的表达量不显著。丁香酚组与模型组比，Grin1基因表达不显著;Grin2a表达量降低显著(P＜0.05);Grin2b表达不显著;Grin2c的表达不显著;Grin2d的表达量不显著;Grin3a表达量差异不显著。丁香酚组与正常组比，Grin1表达差异不显著;Grin2a基因表达量差异不显著;Grin2b表达量差异不显著;Grin2c基因表达量差异不显著;Grin2d的表达量差异不显著;Grin3a表达量差异不显著。Grin3b无表达。
　　⑦Western-Blot结果显示，模型组与正常组比，NR1表达增加极显著(P＜0.01);NR2A蛋白表达增加极显著(P＜0.01);NR2B蛋白表达增加极显著(P＜0.01)。丁香酚组与模型组比，NR1蛋白表达差异不显著;NR2A蛋白表达减少极显著(P＜0.01);NR2B蛋白表达量差异不显著。丁香酚组与正常组比，NR1蛋白表达差异不显著;NR2A蛋白表达增加显著（P＜0.05）;NR2B的蛋白表达增加极显著(P＜0.01)。
　　结论:
　　丁香酚对PC12细胞缺氧损伤具有保护作用，并且可能通过影响NMDAr的NR2A亚基来发挥作用。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献综述

1．1 阿尔茨海默症的研究现状及与缺氧损伤的关系

1．1．1 阿尔茨海默症的流行病学研究

1．1．2 阿尔茨海默症的发病机制

1．1．3 阿尔茨海默症的缺氧机理研究进展

1．1．4 阿尔茨海默症的治疗

1．2 中医对阿尔茨海默症的认识

1．2．1 因虚致呆

1．2．2 因痰致呆

1．3 NMDAr与AD的研究现状

1．3．1 NMDAr亚基的分布与功能

1．3．2 NMDAr在AD发病机制中的作用

1．4 石菖蒲有效成分治疗AD的研究现状及其对丁香酚研究的启示

1．4．1 石菖蒲的神经保护作用

1．4．2 石菖蒲的益智作用

1．4．3 石菖蒲对氧自由基的作用

1．4．4 丁香酚对神经系统的保护作用研究进展

第二章 实验研究

2．1 PC12缺氧损伤模型的建立及丁香酚最适剂量的筛选

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 结果

2．1．4 讨论

2．2 丁香酚对缺氧损伤PC12细胞内钙离子、线粒体膜电位及突触素表达的影响

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．2．3 结果

2．2．4 讨论

2．3 丁香酚对缺氧损伤PC12细胞NMDAr亚基基因表达的影响

2．3．1 实验材料

2．3．2 实验方法

2．3．3 结果

2．3．4 讨论

2．4 丁香酚对缺氧损伤PC12细胞NMDAr亚基蛋白表达的影响

2．4．1 实验材料

2．4．2 实验方法

2．4．3 结果

2．4．4 讨论

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢