基于LC-MS/MS技术的克罗恩病模型大鼠的靶标定量代谢组学研究

摘要

目的:
　　本课题旨在利用高效液相色谱质谱联用技术建立两个定量代谢组学方法，研究克罗恩病(Crohn's disease，CD)大鼠模型中代谢物组成的时间分布规律，从而找出差异代谢物，全面系统探讨2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的克罗恩病模型对大鼠肠道菌群和机体的影响。
　　方法:
　　1.建立同时测定芳香族氨基酸及其肠道菌群-宿主共代谢物的LC-MS/MS方法
　　建立同时测定大鼠血浆、尿液样品中3种芳香族氨基酸(AAA)苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及4个肠道菌群宿主共代谢物吲哚(Indole，I)、对甲酚(p-Cresol, PC)、硫酸吲哚(Indoxyl sulfate，ILS)和硫酸对甲酚(p-Cresylsulfate，PCS)的LC-MS/MS方法。优化色谱、质谱条件，对方法的线性范围、精密度、准确度和稳定性进行考察。
　　2.建立同时测定氨基酸、单胺类神经递质和嘌呤嘧啶的亲水色谱串联质谱(HILIC-MS/MS)方法
　　在前期建立利用HILIC-MS/MS测定血清中、脑中24种氨基酸、4种神经递质和8中嘌呤嘧啶含量的方法，建立测定尿样中32中氨基酸、神经递质和嘌呤嘧啶含量的HILIC-MS/MS方法。分别比较在乙腈和正常大鼠尿液为基质的标准曲线的斜率，考察采用乙腈作为基质配制标准曲线样品是否合理。对方法加样回收率进行考察。
　　3.2，4，6-三硝基苯磺酸诱导的克罗恩病大鼠模型的靶标代谢组学研究
　　以SD大鼠为实验动物，以2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇为造模方法，建立克罗恩病大鼠模型，考察了造模方法和2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇的给药剂量，并以结肠病理切片、结肠大体形态损伤评分和髓过氧化物酶活性为评价标准，对建立的大鼠模型进行评价。
　　最后，将建立的定量代谢组学法应用于大鼠模型获得的生物样品，并对分析所得的数据进行统计学分析，进一步评价建立的大鼠模型，全面系统的探讨2，4，6-三硝基苯磺酸诱导的克罗恩病模型对大鼠肠道菌群和机体的影响。
　　结果:
　　1.建立了同时测定大鼠血浆、尿液样品中Phe、Tyr、Trp及Indole、p-Cresol、Indoxyl sulfate、p-Cresyl sulfate的LC-MS/MS。方法的线性范围、精密度、准确度和稳定性符合生物样品分析方法的要求;方法快速、灵敏，适合生物样品中芳香类氨基酸及其共代谢物的分析。
　　2.建立了包括氨基酸、神经递质和嘌呤嘧啶共31化合物的HILIC-MS/MS方法。斜率比较结果符合要求，表明乙腈作为基质配制标准曲线样品是合理的。方法提取回收率符合生物样品分析方法的要求。其方法样品处理简单，灵敏度高，分析时间短，适合用于大鼠尿样中的靶标代谢组学研究。
　　3.通过将建立的定量代谢组学法应用于CD大鼠模型获得的生物样品，发现造模后大鼠体内代谢物含量与对照组相比变化较大。从尿液中的各代谢物造模过程中含量变化趋势图看出，在造模第1天、第3天时差异最明显，而在第7天时逐渐向对照组靠拢。考虑动物具有自我恢复功能。
　　利用前期建立的HILIC-MS-MS测定CD大鼠模型血中37中氨基酸、单胺类神经递质及嘌呤嘧啶。再通过建立的检测尿中代谢物的方法应用于获得的尿样。结果发现血中变化较大的有16个化合物。而在尿中，由于造模后引起模型组个别大鼠变化很大，造成个体差异太大，虽然没有统计学意义，但仍然可以看出与血样中测得结果大致相同。但都是可以发现在第7天模型组代谢物含量逐渐向对照组靠拢。
　　结论:
　　建立的测定大鼠血浆、尿液的7中芳香类氨基酸及其肠道菌群宿主共代谢物的LC-MS/MS方法和建立的测定大鼠尿液中31中氨基酸、神经递质、嘌呤嘧啶的HILIC-MS/MS方法能成功应用于大鼠克罗恩病模型。

目录

声明

摘要

引言

第一章 综述

1．1 代谢组学

1．1．1 非定量代谢组学与定量代谢组学

1．1．2 研究方法

1．2 克罗恩病

1．2．1 克罗恩病发病机制

1．2．2 克罗恩病模型

1．3 内源性代谢物

1．3．1 肠道菌群宿主共代谢物

1．3．2 氨基酸、单胺类神经递质及嘌呤嘧啶

第二章 建立同时测定芳香族氨基酸及其肠道菌群宿主共代谢物的LC-MS／MS方法

2．1 前言

2．2 仪器与材料

2．2．1 仪器

2．2．2 对照品和试剂

2．3 方法

2．3．1 对照品溶液的配制

2．3．2 样品处理方法

2．3．3 色谱和质谱条件

2．3．4 方法学验证

2．4 结果与讨论

2．4．1 质谱条件优化

2．4．2 色谱条件优化

2．4．3 样品处理方法

2．4．4 方法学验证结果

2．5 本章小结

第三章 建立同时测定氨基酸、单胺类神经递质和嘌呤嘧啶的HILIC-MS／MS方法

3．1 前言

3．2 仪器与材料

3．2．1 仪器

3．2．2 对照品和试剂

3．3 方法

3．3．1 对照品溶液和内标溶液的配制

3．3．2 样晶处理方法

3．3．3 色谱和质谱条件

3．3．3 方法学验证

3．4 结果与讨论

3．4．1 方法的建立

3．4．2 方法学验证结果

3．5 本章小结

第四章 CD大鼠血浆、尿样中芳香类氨基酸及其共代谢物的靶标代谢组学研究

4．1 前言

4．2 仪器与材料

4．2．1 仪器

4．2．2 对照品和试剂

4．2．3 动物

4．3 方法

4．3．1 动物实验

4．3．2 样品处理与测定

4．3．3 数据处理

4．4 结果与讨论

4．4．1 CD模型复制评价

4．4．2 多变量统计分析结果

4．4．3 代谢差异物识别

4．4．4 差异代谢物生物学意义解析

4．5 本章小结

第五章 CD大鼠血清、尿样中31种氨基酸和嘌呤嘧啶的靶标代谢组学研究

5．1 前言

5．2 仪器与材料

5．2．1 仪器

5．2．2 对照品和试剂

5．2．3 动物

5．3 方法

5．3．1 动物实验

5．3．2 样品处理与测定

5．3．3 数据处理

5．4 结果与讨论

5．4．1 多变量统计分析结果

5．4．2 代谢差异物识别

5．4．3 差异代谢物生物学意义解析

5．5 本章小结

结语

参考文献

在校期间发表论文情况

致谢