化痰降浊方对高脂血症痰浊证ApoE-/-小鼠microRNA-33调控脂质代谢机制的研究

摘要

目的：
　　采用高脂饲料喂养复制大鼠高脂血症痰浊证动物模型进行预实验，对其稳定性及可重复性进行评价，在掌握SD大鼠高脂血症痰浊证“病证结合”动物模型的基础上，以ApoE-/-小鼠动物模型为研究对象，采用化痰降浊方进行干预，通过定量分析miR-33及其靶基因ABCA1、ABCG1及HMGCR和相应蛋白质的表达水平，揭示化痰降浊方通过miR-33调控高脂血症痰浊证脂质代谢的作用机制。
　　方法：
　　（一）高脂血症痰浊证大鼠“病证结合”动物模型的复制和预试验
　　以复制高脂血症痰浊证大鼠动物模型作为预实验，评价高脂血症痰浊证“病证结合”动物模型的稳定性和可重复性。
　　1.SD大鼠高脂血症痰浊证“病证结合”动物模型稳定性评价
　　将30只8周龄雄性SD大鼠随机分为正常组和模型组，正常组和模型组分别采用普通饲料和高脂饲料喂养，于喂养后的第4、6、8周末分别进行眼眶后静脉丛取血，检测血清中的TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平，于第8周末处死后取肝脏及主动脉制作HE染色病理切片，记录整个实验过程中各组的饮食、饮水、体重等一般情况，评价成模情况及模型的稳定性。
　　2.大鼠高脂血症痰浊证“病证结合”动物模型重复性评价
　　将16只8周龄雄性SD大鼠随机分为正常组和模型组，分别采用普通饲料和高脂饲料喂养8周，记录各组大鼠的饮食、饮水、体重等一般情况，于第8周末行眼眶后静脉丛取血后处死，检测血清血脂四项水平，与第一次实验结果进行对比分析，评价模型可重复性。
　　（二）化痰降浊方对高脂血症痰浊证ApoE-/-小鼠microRNA-33调控脂质代谢机制的研究
　　将50只ApoE-/-小鼠随机分为正常对照组8只和高脂饲料组42只，分别采用普通饲料和高脂饲料喂养，在第4周末，检测所有小鼠的血脂四项水平，按TC值将高脂喂养组小鼠随机分为模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、西药组，实验过程中记录各组小鼠的饮水量、饮食量、体重等一般情况。按相应的给药方案给药4周后，取血检测血清血脂四项水平，取肝脏及主动脉制作HE染色病理切片，肝脏组织做Q-PCR实验检测miR-33、ABCA1、ABCG1及HMGCR基因的表达量，western-blot实验检测肝脏中ABCA1、ABCG1及HMGCR蛋白的相对表达量。
　　结果：
　　（一）高脂血症痰浊证大鼠“病证结合”动物模型的复制和预试验结果
　　1.大鼠高脂血症痰浊证“病证结合”动物模型具有稳定性
　　第4、6周末，模型组大鼠的体重、平均饮食量、饮水量与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。第8周末，模型组大鼠体重、饮水量高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）;模型组饮食量与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但观察模型组大鼠从6周末开始有啃咬饲料的情况，实际进食量少于正常组。
　　高脂饲料喂养SD大鼠4周后，模型组TC明显升高，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）;TG、LDL-C、HDL-C稍有升高，与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组6周末TC水平与4周末水平比较稍有下降，两者比较，差异无统计学意义（P＞0.05），与正常组比较，差异有统计学意义（P0.05）;模型组6周末的TG、LDL-C、HDL-C水平与正常组比较，差异无统计学意义。8周末模型组血脂四项与正常组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果提示，高脂饲料喂养SD大鼠模型以TC升高为主要改变，在第4周末其水平最佳。
　　2.大鼠高脂血症痰浊证“病证结合”动物模型重复性评价
　　高脂饲料喂养8周后，模型组的TC、TG、LDL-C均高于正常组，HDL-C低于正常组，血脂四项与正常组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。
　　预实验结果提示:高脂饲料喂养SD大鼠复制高脂血症痰浊证动物模型以造模4周较为合适，具有稳定性和可重复性。本预实验所建立的方法和技术，为进一步开展ApoE-/-小鼠脂质代谢调控机制的研究奠定了坚实的基础。
　　（二）化痰降浊方对高脂血症痰浊证ApoE-/-小鼠microRNA-33调控脂质代谢机制研究结果
　　1.各组小鼠的一般情况
　　造模第4周末，各组小鼠的自主活动能力、对外界刺激的反应度等与造模前比较无明显变化;正常对照组体重、平均饮水量，与高脂喂养模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）;高脂喂养模型组平均饮食量减少，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果提示:4周末时高脂喂养组已具备高脂血症痰浊证动物模型的特点。
　　开始给药后，各组小鼠的主动活动频率均有减少，以中药低、中、高剂量组较为明显;给药4周结束后，观察各组饮食量发现，中药中剂量组平均饮食量增多，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05);观察各组饮水量发现，中药低、中、高剂量组的平均饮水量减少，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）;中药高剂量组小鼠的终末体重降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其余各组小鼠体重与模型组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　2.各组小鼠血脂四项水平
　　经过4周高脂喂养造模结束后，各组高脂喂养小鼠的血脂四项水平明显升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示高脂血症模型复制成功。高脂喂养各组间血脂四项差异均无统计学意义（P＞0.05），提示各组间血脂水平基线一致，具有可比性。正常对照组的TC、TG、 LDL-C在给药前后水平都明显低于模型组，结果提示高脂饲料能促进ApoE-/-小鼠血脂水平升高，能成功建立高脂血症模型，与高脂喂养4周的SD大鼠的血脂水平比较，ApoE-/-小鼠的血脂水平显著升高（P＜0.05）。
　　给药4周后，西药组的TC、TG、LDL-C水平均降低，HDL-C水平升高，与给药前及模型组比较，疗效显著。中药治疗组的疗效参差不齐，中药高剂量组的TG治疗后明显下降，其疗效与西药相当，但大部分指标与治疗前及模型组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
　　3.肝脏和主动脉病理切片结果
　　给药4周后，各组小鼠的肝脏湿重与肝系数与模型组比较，差异无统计意义（P＞0.05）。中药低中高剂量组、西药组肝系数增大，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。高脂喂养组的肝脏脂肪变表现为脂肪空泡数量较多，大小不一，部分细胞核偏向一侧，部分可见点状坏死及淋巴细胞浸润，随着中药给药浓度的升高，肝脏脂肪化的程度逐渐减轻。各组主动脉内膜、中膜、外模结构轻微紊乱，平滑肌排列轻度不规则。
　　4.各组小鼠miR-33、ABCA1、ABCG1、HMGCR基因和相应蛋白的表达
　　中药低剂量组、中药高剂量组、西药组的miR-33基因水平下降，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）;中药高剂量组的ABCG1、HMGCR基因表达水平下降，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　ABCA1、ABCG1、HMGCR蛋白水平各组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：
　　（一）高脂饲料喂养SD大鼠复制高脂血症痰浊证动物模型以4周为宜，具有稳定性和可重复性，所建立的方法和技术，为进一步开展ApoE-/-小鼠脂质代谢调控机制研究奠定了坚实的基础。
　　（二）初步探索建立高脂血症痰浊证“病证结合”动物模型评价指标，主要包括:①血脂水平异常;②肥胖;③倦怠;④饮食量与饮水量减少。
　　（三）高脂饲料喂养能加速ApoE-/-小鼠血脂紊乱，血脂水平显著升高。化痰降浊方能控制ApoE-/-小鼠的血脂水平，血脂四项在给药期间均维持造模结束后的水平，其中中药高剂量组疗效最佳，能减轻小鼠体重，改善厌食情况。
　　（四）化痰降浊方能抑制miR-33和HMGCR基因的表达，从而调节其参与的脂质代谢环节。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献综述

第一节 对高脂血症的认识与研究进展

一、中医对高脂血症病因病机的认识

二、高脂血症与痰浊证的关系

三、中医药治疗高脂血症

四、高脂血症治疗新靶点

五、小结与展望

第二节 中医病证结合动物模型评价的现状分析

一、造模因素评价

二、症状评价

三、客观指标评价

四、以方测证

五、其他

六、结语

第三节 miR-33及其靶基因在脂质代谢中的研究进展

一、miR-33在脂质代谢中的作用

二、ABCA1和ABCG1在脂质代谢中的作用

三、其他与脂质代谢相关的miRNAs

四、小结

第二章 研究方案

一、研究假说

二、研究内容

三、研究方法

四、预期目标

第三章 实验研究

一、大鼠高脂血症痰浊证“病证结合”动物模型稳定性评价

二、大鼠高脂血症痰浊证“病证结合”动物模型重复性评价

第二节 化痰降浊方对高脂血症痰浊证ApoE-／-小鼠microRNA-33调节脂质代谢机制的研究

一、材料

二、方法

三、结果

四、结论

五、讨论

结语

参考文献

附录

在校期间发表的论文情况

致谢