石斛酚、丁香酸与人晶状体上皮细胞相互作用机制研究

摘要

目的:
　　研究石斛酚(gigantol)、丁香酸(syringic acid)与人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLECs)相互作用机制，从单个活细胞的力学形态方面阐明石斛抗糖尿病性白内障(diabetic cataract，DC)的作用机制。
　　方法:
　　1.采用透射电镜(transmission electron microscope，TEM)检测石斛酚、丁香酸作用于高浓度葡萄糖(50mM)造模之后的HLECs的细胞内超微结构，对其细胞内的细胞核、线粒体、内质网等结构变化进行详细地考察;
　　2.在活细胞条件下，利用原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)对石斛酚、丁香酸作用于高葡萄糖造模之后的单个HLECs细胞表面形貌变化进行成像，并通过单个活细胞的表面形貌计算药物作用之后的细胞表面粗糙度与细胞硬度等细胞力学形态性质的改变;
　　3.利用表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)，分别对石斛酚、丁香酸作用于高葡萄糖造模时间24h与48h之后的HLECs细胞膜磷脂结构C-C链的链内与链间的结构变化进行考察，并通过拉曼光谱相对强度的变化计算石斛酚、丁香酸对HLECs细胞膜流动性的具体影响;
　　4.利用细胞免疫荧光的检测方法，通过激光共聚焦扫描显微镜考察石斛酚、丁香酸作用于葡萄糖造模之后HLECs细胞的骨架蛋白F-actin的影响。
　　结果:
　　1.通过TEM实验考察结果显示:在正常组中，HLECs细胞内的结构呈现出正常细胞形态，细胞核的染色质均匀分布，并且线粒体嵴清晰、完整;在模型组中，利用高浓度葡萄糖对HLECs造模之后，HLECs内的细胞结构表现出明显病理特征，细胞质里面出现大量空泡现象，细胞核内的染色质发生明显沉积，颜色加深，而细胞器线粒体则表现出明显的肿胀现象，其线粒体嵴发生断裂，及纹路模糊的现象，内质网也呈现出明显的肿胀现象;而通过药物石斛酚、丁香酸作用于之后，HLECs细胞内结构的病理程度得到相应地改善，可以发现细胞核中染色质聚集现象减轻，分布较均匀，而线粒体与内质网的肿胀程度也得到相应地减轻，线粒体嵴恢复至完整状态，并且石斛酚药物组对高浓度葡萄糖造模之后HLECs细胞内结构病理变化的减轻程度优于丁香酸药物组。
　　2.通过AFM在活细胞条件下对HLECs的细胞表面形貌进行考察之后，结果显示:在正常组中，细胞高度为3.5±0.35μm，细胞表面粗糙度Ra为112±3.25nm，Rq为155±2.98nm，细胞硬度为5.6±0.56KPa;在模型组中，HLECs细胞高度与细胞硬度发生了明显地变化，细胞高度为1.8±0.25μm，细胞表面粗糙度Ra为144±2.16nm，Rq为176±2.67nm，细胞硬度为11.6±0.91KPa，细胞高度明显降低，细胞粗糙度与细胞硬度明显升高，与正常组相比，差异具有统计学意义，P＜0.01;石斛酚药物组，细胞高度为3.1±0.15μm，细胞表面粗糙度Ra为114±3.45nm，Rq为135±5.12nm,细胞硬度为7.5±0.45KPa，与模型组相比，细胞高度明显上升，细胞粗糙度与细胞硬度明显降低，差异具有统计学意义，P＜0.01;丁香酸药物组中，细胞高度为2.8±0.25μm，Ra为132±4.12nm，Rq为161±3.91nm，细胞硬度为8.9±0.45KPa，与模型组相比，细胞高度明显上升，细胞表面粗糙度与细胞硬度降低，差异具有统计学意义，P＜0.05;石斛酚与丁香酸药物联合组中，3.8±0.43μm，细胞表面粗糙度Ra为104±4.21nm，Rq为121±2.76nm，细胞硬度为7.51±0.31KPa，与模型组相比，细胞高度升高，粗糙度与细胞硬度降低，差异具有统计学意义，P＜0.01。此结果显示出石斛酚、丁香酸可以在一定程度上恢复高糖造模之后的HLECs的细胞表面粗糙度、细胞硬度等细胞力学形态性质;
　　3.通过拉曼光谱实验，结果显示:在模型中，HLECs的细胞膜磷脂结构中的C-C链内的纵向有序性参数Strans和横向相互作用参数Slat较正常组升高了25％和25.9％，细胞膜的流动性降低，差异具有统计学意义，P＜0.01;在石斛酚组中，Strans与Slat较模型组降低了16％和20％，细胞膜的流动性上升，差异具有统计学意义，P＜0.01;在丁香酸组中，Strans与Slat较模型组降低了2.9％和3％;石斛酚与丁香酸联合组中，Strans与Slat较模型组降低了5％和20.8％，细胞膜的流动性上升，差异具有统计学意义，P＜0.01。由此，药物石斛酚、丁香酸可以在一定程度上有效地升高HLECs的细胞流动性。
　　4.通过激光共聚焦对细胞免疫荧光检测之后，结果显示:在正常组中，细胞骨架蛋白F-actin的排列有序，靠近细胞膜;在模型组中，骨架蛋白F-actin的排列表现出弥散，杂乱现象，在细胞膜附近的比列减少;而在石斛酚、丁香酸药物组，使HLECs的细胞骨架蛋白F-actin的表达与排列有序程度得到一定程度上的恢复，显示出药物石斛酚与丁香酸可以在一定程度上恢复细胞HLECs的细胞骨架的有序性。
　　结论:
　　石斛酚、丁香酸能有效地降低高浓度葡萄糖所致的HLECs细胞内结构的病理损伤，以及高糖造模之后的HLECs细胞力学形态的变化。在此过程中石斛酚、丁香酸通过影响HLECs的细胞膜脂质结构的C-C链及细胞骨架结构的有序度达到增强HLECs的细胞流动性，进一步有效降低HLECs细胞膜表面粗糙度和细胞硬度，由此达到改善细胞力学形态作用。由此石斛酚与丁香酸可以通过改变HLECs的细胞力学形态进一步发挥抗糖尿病性白内障的药理作用，在单细胞动态成像水平上为石斛抗糖尿病性白内障提供基础资料。

目录

声明

摘要

引言

第一章 研究背景及综述

1．1 药物分子与细胞之间的相互作用研究意义

1．2 药物分子与细胞之间的作用研究进展

1．2．1 药物分子与细胞之间的相互作用过程中，药物有效性，及其作用机制的研究

1．2．2 药物分子与细胞之间相互作用过程中，药物进出细胞的运输效率及机制研究

1．2．3 药物分子与细胞之间相互作用过程中，细胞形态学的考察与研究

1．3 药物分子与细胞之间相互作用方法的研究进展

1．4 药物分子石斛酚、丁香酸的研究进展

第二章 实验内容

2．1 实验材料与设备

2．1．1 主要材料与试剂

2．1．2 仪器

2．1 实验方法

2．2．1 药物配置与实验分组

2．2．2 HLECs的细胞培养

2．2．3 利用透射电镜观察石斛酚、丁香酸作用于高糖造模之后的HLECs的细胞内结构变化

2．2．4 利用原子力显微镜对石斛酚、丁香酸作用于高浓度葡萄糖造模之后的HLECs的细胞表面形貌变化进行检测与分析

2．2．5 利用激光共聚焦扫描显微镜对石斛酚、丁香酸作用于高浓度葡萄糖造模之后的HLECs的细胞骨架蛋白F-act i n的变化进行检测

2．2．6 拉曼光谱检测石斛酚、丁香酸作用高糖造模之后的HLECs的细胞流动性的影响

2．3．1 透射电镜观察石斛酚、丁香酸作用于高浓度葡萄糖造模之后的HLECs的细胞内部结构变化的检测结果

2．3．2 利用原子力显微镜对石斛酚、丁香酸作用于高浓度葡萄糖造模之后的HLECs的细胞表面形貌变化的检测结果

2．3．3 利用原子力显微镜对石斛酚、丁香酸作用于高浓度葡萄糖造模之后的HLECs的细胞高度的检测结果

2．3．4 石斛酚、丁香酸对高浓度葡萄糖造模之后的HLECs的细胞表面粗糙度的检测结果

2．3．5 石斛酚、丁香酸对高浓度葡萄糖造模之后的HLECs的细胞表面粗糙度的检测结果

2．3．6 通过激光共聚焦扫描显微镜对石斛酚、丁香酸作用于高浓度葡萄糖造模之后的HLECs的细胞骨架蛋白F-act n影响的检测结果

2．3．7 利用表面增强拉曼光谱对石斛酚、丁香酸作用于高浓度葡萄糖造模之后的HLECs的细胞流动性影响的实验结果

2．4 讨论

第三章 结语与展望

3．1 结语

3．2 展望

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢