双酚A抗体的制备及荧光偏振免疫分析研究

摘要

双酚A(BPA)是一种环境类激素，具有一定的生物毒性，影响生态环境并威胁人类的安全健康。双酚A可以导致婴幼儿早熟、孕妇流产、前列腺癌等，影响人体的内分泌系统，破坏DNA，也被认为是一种内分泌干扰物。然而双酚A又是一种重要并应用广泛的有机化工原料，在生产和使用过程中，双酚A会迁移到环境中，威胁人类健康。为了保障生态系统的安全和人类的健康，控制双酚A在环境中的残留，并建立双酚A的快速检测方法，显得尤为重要。
　　本论文根据双酚A的特定结构，选择类似物双酚酸BVA作为半抗原，偶联牛血清白蛋白BSA，制备完全人工免疫抗原BVA-BSA，免疫Balb/c小鼠，制备免疫脾细胞，与体外培养的骨髓瘤SP2/0细胞融合，并经过间接ELISA检测筛选和有限稀释法亚克隆，得到阳性杂交瘤细胞株，并注射到不完全佐剂致敏的Balb/c小鼠腹腔，制备小鼠腹水，即单克隆抗体。单抗经过辛酸-硫酸铵法纯化，SDS-PAGE以及间接竞争ELISA方法鉴定，得到高特异性高灵敏度的双酚A单克隆抗体，并用于分析检测环境样品中双酚A残留量。
　　荧光示踪物是由荧光素与半抗原偶联得到。本实验选择三种荧光素(lysFITC、EDF、AMF)进行制备荧光标记物，其中lysFITC和EDF是由FITC衍生而来，三种荧光素与活化的双酚酸的羧基结合，得到荧光素标记物，并经过TLC分离纯化和FPIA鉴定，最终筛选出BVA-AMF为该实验的最佳荧光示踪物，并用于建立荧光偏振免疫分析方法。
　　基于双酚A单克隆抗体和荧光示踪物成功制备的基础上，建立荧光偏振免疫分析法FPIA，用于检测样品中的双酚A含量，检测限为5.6ng/mL，IC50为140.6ng/mL，线性范围为11.32-904.21ng/mL，相关系数R2=0.9913。并结合仪器方法HPLC和酶免方法ELISA对FPIA方法进行验证，三种方法同时对环境水样品做添加回收试验，FPIA的回收率为87.91-114.28％，HPLC法为85.40-104.18％，ELISA法为92.60-112.70％，FPIA法与HPLC法的相似度为0.9971，FPIA法与ELISA法的相似度为0.9964。由此可知，荧光偏振免疫分析方法的实验结果准确可靠，适用于分析检测样品中双酚A的残留量。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 双酚A概述

1．1．1 双酚A理化性质

1．1．2 双酚A的应用

1．1．3 双酚A的污染及危害

1．2 双酚A分析检测方法研究进展

1．2．1 仪器分析法

1．2．2 免疫分析测试技术

1．2．3 荧光偏振免疫分析法

1．3 课题研究目的及其意义

1．4 研究思路及内容

1．5 课题来源

第二章 抗原的合成与鉴定

2．1 引言

2．2 试剂与仪器

2．2．1 实验仪器与耗材

2．2．2 常用的缓冲液的配制

2．3 实验方法

2．3．1 双酚A完全抗原的合成

2．3．2 双酚A完全抗原的鉴定

2．4 结果分析

2．4．1 双酚A完全抗原的紫外光谱扫描结果

2．4．2 双酚A完全抗原的红外光谱扫描结果

2．4．3 双酚A完全抗原SDS-PAGE鉴定结果

2．5 小结与讨论

2．5．1 小结

2．5．2 讨论

第三章 双酚A单克隆抗体的制备及其鉴定

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 实验动物及细胞

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要仪器

3．2．4 溶液配制

3．3 实验方法

3．3．1 动物免疫

3．3．2 抗体效价测定

3．3．3 制备杂交瘤细胞

3．3．4 杂交瘤的筛选及亚克隆

3．3．5 单克隆抗体的大量制备

3．3．6 腹水抗体的纯化与纯度鉴定

3．3．7 单克隆抗体的保存

3．3．8 抗体含量的测定

3．3．9 纯化前后抗体效价测定

3．3．10 抗体亚型的鉴定

3．4 结果与讨论

3．4．1 免疫血清效价的测定

3．4．2 杂交瘤细胞的培养和筛选

3．4．3 SDS-PAGE测定抗体纯度

3．4．4 BCA法测定单克隆抗体的含量

3．4．5 单克隆抗体纯化前后效价的变化

3．4．6 单克隆抗体竞争抑制实验

3．4．7 单克隆抗体亚型鉴定

3．5 小结

第四章 荧光偏振免疫分析法的建立

4．1 前言

4．2 试剂与仪器

4．2．1 试剂

4．2．2 仪器

4．3 方法

4．3．1 荧光标记物的制备

4．3．2 荧光标记物的纯化

4．3．3 荧光标记物浓度的确定

4．3．4 双酚A单克隆抗体浓度的确定

4．3．5 竞争荧光偏振免疫分析法的建立

4．3．6 标准曲线的建立及数据处理方法

4．3．7 双酚A荧光偏振免疫分析方法特异性的测定

4．3．8 样品处理及测定

4．3．9 高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫吸附法(ELISA)验证

4．4 结果与分析

4．4．1 荧光标记物的制备及纯化

4．4．2 荧光标记物浓度的确定

4．4．3 抗体稀释曲线

4．4．4 标准曲线的绘制

4．4．5 交叉反应率

4．4．6 HPLC分析结果讨论及方法比对

4．4．7 环境水样的加样回收率

4．5 小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士期间发表的论文

声明

致谢