用于肿瘤个体化医疗的3D细胞培养模型的建立及特点研究

摘要

二维细胞培养模型(Two dimensional cells culture model，2D culture)缺乏源组织微环境导致细胞结构与体内存在显著差异，从而导致药物响应模式及信号分子通路的表达与生物体内显著不同。动物实验周期长，操作复杂，实验成本高并且存在个体性差异，不利于临床应用。肿瘤细胞三维培养模型(Three dimensional cells culture model，3D culture)可模拟体内肿瘤细胞生长微环境，使体外肿瘤细胞生长和相关信号通路的调控近似源组织。在本课题中，我们试图建立可用于肿瘤个体化医疗的前列腺癌细胞3D培养模型。主要研究内容及结果如下:
　　1.建立基于Matrigel的前列腺癌细胞3D培养模型。分析基于Matrigel的3D培养模型的PC3细胞形态学和增殖动力学，结果发现PC3细胞在Matrigel基质中形成了类似于源组织的枝节状腺体组织结构的致密肿瘤细胞球体，PC3细胞在Matrigel基质中增生并在长时间内保持高活力，这一结果近似肿瘤细胞在体内的生长特点。此外，通过检测13种抗肿瘤药物对PC3细胞的增殖抑制作用并计算IC50，结果发现有11个药物对2D培养模型和基于Matrigel的3D模型的PC3细胞的IC50值存在显著差异。PC3细胞在Matrigel基质中具有明显的药物不敏感性。
　　2.进一步建立基于Alginate-HA的前列腺癌细胞3D微载体球培养模型，为今后建立可用于流式细胞仪检测的3D培养模型奠定基础。在研究中比较2D培养模型和基于Alginate-HA的3D微载体球培养模型的前列腺癌细胞形态学、生长因子(IL-8和VEGF)、基质金属蛋白酶MMPs(MMP-2,MMP-3,MMP-9)、EMT过程生物标志物(N-Cadherin，Vimentin、β6 integrin)及凋亡蛋白caspase-3的表达水平，结果显示，前列腺癌细胞在Alginate-HA微载体球中IL-8和VEGF表达水平显著上调，肿瘤细胞恶性表型显著增强。此外，MMPs及EMT过程生物标志物的表达水平大幅度上调，表明肿瘤细胞在Alginate-HA微载球中侵袭和转移潜力显著增强，在一定程度上重现了体内肿瘤细胞的侵袭和转移模式。经过药物处理后，微载体球中3D细胞的caspase-3活性明显低于2D细胞，具有明显的凋亡耐受性。
　　3.前列腺癌细胞体内外培养模型药效学一致性评价。本研究分析2D培养模型、基于Matrigel的3D培养模型、基于Alginate-HA的3D微载体球培养模型和裸鼠移植瘤模型经药物处理后caspase-3和Bcl-2的活性。结果发现两种3D培养模型和体内模型的凋亡程度接近，并且明显比2D培养模型具有更强的凋亡耐受性。这表明，两种3D培养模型药物应答模式与体内相似，可用于替代动物实验进行抗肿瘤药物药效评价。此外，基于Matrigel的3D培养模型价格昂贵，而基于Alginate-HA的3D微载体球培养模型的成本仅约为其1/3,并且有望在未来的研究中开发出能用于流式细胞检测和微流控的三维细胞培养模型，更适合于肿瘤个性化用药指导。
　　创新点:本文首次应用Alginate-HA微载体球对前列腺癌细胞进行3D培养，并且第一次系统评价2D培养模型、3D培养模型和体内模型对临床常用抗癌药物响应的一致性，建立了用于肿瘤个体化医疗的药物敏感度检测的3D培养模型。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 3D培养技术

1．2．1 3D培养技术的定义

1．2．2 2D培养和器官型培养的局限性

1．2．3 3D培养的优势

1．3 3D培养方法

1．3．1 细胞自发性聚集

1．3．2 液体覆盖培养

1．3．3 微载体珠培养

1．3．4 预制支架培养

1．3．5 旋转烧瓶培养

1．3．6 旋转细胞培养系统

1．4 在3D培养中重构肿瘤微环境

1．4．1 肿瘤-基质的交互作用

1．4．2 细胞-细胞间黏附及信号分子

1．5 3D培养技术在肿瘤研究领域的应用

1．5．1 在肿瘤个体化医疗方面的应用

1．5．2 在肿瘤耐药性研究方面的应用

1．5．3 在肿瘤微血管形成方面研究的应用

1．6 本论文研究的目的、意义和内容

第二章 基于Matrigel的前列腺癌3D培养模型的建立和验证

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 实验仪器与试剂

2．2．2 细胞2D培养

2．2．3 MTT比色法测定细胞生长曲线

2．2．4 基于Matrigel的细胞3D培养

2．2．5 台盼蓝拒染法

2．2．6 WST-8法

2．2．7 数据统计与分析

2．3 实验结果

2．3．1 前列腺癌细胞生长曲线

2．3．2 3D培养细胞形态学分析

2．3．3 细胞增殖分析

2．3．4 药物对PC3细胞的增殖毒性分析

2．4 小结与讨论

第三章 基于Alginate-HA的前列腺癌3D培养模型的建立和验证

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 实验仪器与试剂

3．2．2 2D细胞培养

3．2．3 基于Alginate-HA的细胞3D培养

3．2．4 苏木精-伊红染色(H．E．染色)

3．2．5 酶联免疫吸附法(ELISA)

3．2．6 免疫荧光染色法(IF)

3．2．7 荧光素酶法测定caspase-3含量

3．2．8 数据统计与分析

3．3 实验结果

3．3．1 细胞形态学分析

3．3．2 肿瘤恶性表型生长因子表达分析

3．3．3 EMT过程分子标志物的表达

3．4 基于Alginate-HA的3D培养的细胞具有更强的凋亡耐受性

3．5 小结与讨论

第四章 体内外模型药效学一致性评价

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 实验仪器及试剂

4．2．2 裸鼠移植瘤模型的建立及抗肿瘤药物对其抑制作用研究

4．2．3 免疫组织化学法(IHC)

4．2．4 凋亡蛋白表达量测定

4．3 数据统计与分析

4．4 实验结果

4．4．1 抗肿瘤药物对PC3细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

4．4．2 免疫组化阳性率分析

4．4．3 肿瘤细胞体内外培养模型的细胞凋亡情况分析

4．5 小结与讨论

总结与展望

参考文献

攻读硕士研究生期间发表的论文与专利

声明

致谢