曲霉泛素结合酶基因的克隆与生物信息学分析

摘要

盐胁迫是抑制植物生长，降低农作物产量的主要环境因素之一。长期以来，关于如何提高植物的抗盐性，增加在盐胁迫下农作物的产量一直是人们关注的焦点。基于以上事实，培养出抗盐植物对人类的生产生活已经迫在眉睫。本论文基于的实验是抗盐曲霉的泛素结合酶基因的克隆，分析该克隆基因，以期对转基因植物等基因工程方面做出贡献。
　　本文中曲霉生理小种鉴别等试验条件及材料由吉林大学植物科学学院张世宏实验室提供。实验材料曲霉具有极强的抗盐性，预示着曲霉可能存在调控或者直接赋予其抗盐功能的多类基因。其中泛素——蛋白酶体系统在生物的生长和发育过程中扮演着重要角色，不仅保证植物的正常生理机能，而且维持植物在逆境中基本生存状态。泛素结合酶可终止对靶蛋白的降解，决定靶蛋白的调控。所以泛素结合酶是细胞代谢中其重要作用的决定因子。
　　基于泛素结合酶独特的抗盐功能，本研究从对曲霉进行总RNA的提取，反转录成总cDNA，根据文库测序已知的5’序列，通过3’RACE，扩增出缺失序列，拼接，获得该曲霉的全长拼接基因，根据该拼接基因设计E2的全长基因特异性引物，扩增测序的结果与拼接结果对比，结果在可信范围百分比内，获得全长基因。综上所述，曲霉ESTs序列中发现的这个包含泛素结合酶功能域的cDNA序列，经文库筛选，测序鉴定和生物信息学分析，推测克隆得到的基因为泛素结合酶基因。构建真核表达载体，预计利用农杆菌介导的转化技术对拟南芥进行侵染，从而达到遗传转化的目的，并得到遗传上纯和的转基因植物。
　　对推测克隆得到的泛素结合酶基因进行生物信息学分析，获得以下信息：
　　1.曲霉UBE2的分子量大小为16.6ku,其碱性氨基酸（K、R）、酸性氨基酸（D、E）、疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）和极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）含量分别为15、16、45和41个，等电点为PH6.4。
　　2.曲霉UBE2序列的第62～64nt处是该cDNA序列的第一个密码子，第62～505nt处是一个完整的ORF，编码一个147AA的蛋白序列。
　　3.以克隆得到的cDNA推导出的氨基酸序列为探针对GenBank中的非冗余蛋白质数据库进行BlastP分析，结果发现玉米（Zeamays）﹑酿酒酵母﹑斑马鱼（Daniorerio）﹑日本凋毛藻（Griffithsiajaponica）﹑拟南芥和牛（Bostaurus）的泛素结合酶基因的序列一致性分别为84﹪﹑83﹪﹑85﹪﹑88﹪﹑80﹪和83﹪。
　　4.预测结果中E2的α螺旋约占33.33﹪,β延伸链约占19.05﹪，无规则卷曲占47.62﹪。
　　5.对曲霉E2保守结构域的分析，显示曲霉E2第4～136位属于泛素结合酶家族，第74～89位为泛素结合酶活性位点并具有下列保守序列［FYWLSP］-H-［PC］-［NHL］-［LIV］-x（3,4）-G-x-［LIVP］-C-［LIV］-x(1,2)-［LIVR］。
　　综合生物信息学分析结果推测，泛素结合酶基因的超量表达可能通过调节靶蛋白的活性，从而调控转基因植物的胁迫响应。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

1文献综述

1.1泛素结合酶的相关知识

1.2 实验所用毕赤酵母背景

1.3植物与盐胁迫

1.4本研究的目的与意义

2材料与方法

2.1材料

2.2实验方法

3实验内容及结果

3.1曲霉泛素结合酶基因的克隆与序列分析

3.2后续的转基因任务

3.3实验结果

4实验分析及讨论

4.1曲霉泛素结合酶基因的生物信息学分析

4.2讨论

参考文献

硕士期间发表文章

致谢