Canstatin-N基因在E.coli和P.pastoris中表达及其活性分析

摘要

本研究克隆了人血管能抑素N端基因，实现在大肠杆菌和酵母中表达。 以重组质粒pET-CN为模板设计引物CASN1N和CASN2，PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段，用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切将其克隆进pET-22b(+)载体获得重组表达质粒pET-22b(+)-CN，转化E.coliBL21(DE3)，在IPTG诱导下，人血管能抑素N端基因片段获得了高效表达，主要以包涵体形式存在。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响，结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0.1mmol/L；37℃下诱导培养2h时产物表达量最高。利用镍琼脂糖凝胶FF亲和柱层析对重组蛋白进行了初步的纯化研究。抗血清经去除其中的交叉反应抗体后进行Westernblotting分析。结果显示兔抗人血管能抑素抗血清能特异地与人血管能抑素N端起抗原抗体反应。在CAM试验中人血管能抑素N端片段抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管的形成。 将克隆的Canstatin-N基因重组进胞内表达质粒pPIC9KIC获得含该基因的重组表达载体pPIC9KIC-CN，用SalⅠ线性化重组质粒后，用电激法将重组载体转化毕赤酵母GS115，经PCR检测获得含人血管能抑素基因的酵母工程菌。通过G418筛选法获得多拷贝重组菌株。重组菌株在甲醇诱导下表达目的蛋白。SDS-PAGE分析结果显示，在甲醇诱导下，Canstatin-N蛋白成功地获得了胞内表达。抗血清经去除其中的交叉反应抗体后进行Westernblotting分析。结果显示兔抗人血管能抑素抗血清能特异地与人血管能抑素N端起抗原抗体反应。经过初步纯化，将目的蛋白进行CAM血管生成抑制活性分析，CAM试验证明在.P.pastoris胞内表达的Canstatin-N重组人血管能抑素能抑制CAM血管生成。P.pastoris中表达产物的活性较E.coli中表达的好。 综上所述，本研究克隆了人血管能抑素N端基因，实现在大肠杆菌和酵母中表达。证明了人血管能抑素N端具有生物活性，人血管能抑素N端在体内有抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管形成。P.pastoris中表达产物的活性较E.coli中表达的好。为寻找高效的新的血管生成抑制因子和抗癌蛋白打下了良好基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1肿瘤与血管生成

1.2血管生成抑制因子的研究进展

1.3 Canstatin的发现

1.4 Canstatin的生物学特性

1.5大肠杆菌表达系统

1.5.1表达调控

1.5.2启动子

1.5.3宿主细胞

1.5.4包涵体的形成

1.6 P.pastoris表达系统

1.6.1 P.pastoris表达系统的优点

1.6.2 PAOX1表达系统

1.6.3 PGAP表达系统

1.6.4 pFLD1表达系统

1.6.5 pYPT1表达系统

1.6.6 pICL1表达系统

1.6.7基因序列的密码子偏爱

1.6.8甲醇诱导型表达体系的缺陷及对策

1.6.9 Epastoris在生产外源蛋白中的应用

1.7本研究的目的及意义

1.8本研究的技术路线

第1章Canstatin-N基因在E.coli中表达及其活性分析

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.2方法

1.2结果与分析

1.2.1人血管能抑素N端基因片段扩增和表达载体pET-22b(+)-CN的构建

1.2.2表达质粒pET-22b(+)-CN的酶切鉴定

1.2.3人血管能抑素N端基因片段序列分析

1.2.4人血管能抑素N端基因片段在大肠杆菌中诱导表达

1.2.5诱导人血管能抑素基因表达的最佳时间

1.2.6诱导人血管能抑素表达的最佳IPTG浓度

1.2.7人血管能抑素N端片段的Western Blotting分析

1.2.8人血管能抑素N端片段抑制鸡胚CAM新生血管生成

1.3讨论

1.4结论

第2章Canstatin-N基因在P.pastoris中表达及其活性分析

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1人血管能抑素N端基因片段扩增和表达载体的构建

2.2.2表达载体的酶切鉴定

2.2.3人血管能抑素N端基因片段序列分析

2.2.4含Canstatin-N基因的酵母工程菌构建

2.2.5在G418平板上筛选高拷贝整合的重组转化子

2.2.6 Canstatin-N基因在P.pastoris中的诱导表达

2.2.7表达产物的免疫分析

2.2.8人血管能抑素N端片段抑制鸡胚CAM新生血管生成

2.3讨论

2.4结论

参考文献

附录：缩写词(Abbreviation)

致谢