CPUHY002对肝微粒体CYP450同工酶的体外抑制作用

摘要

目的：采用Cocktail法评价CPUHY002在体外对大鼠、Beagle犬和人肝微粒体C YP450酶的6种同工酶活性的影响，预测CPUHY002对主要CYP450酶的抑制作用，为CPUHY002的临床研究和临床用药提供参考。
　　方法：建立测定探针代谢物对乙酰氨基酚、4-羟基双氯酚酸、5-羟基奥美拉唑、右啡烷、6-羟基氯唑沙宗、6β-羟基睾酮浓度的LC-MS/MS法，并进行方法学验证。选择10μmol.L-1非那西丁和100μmol.L-1双氯酚酸钠两个探针药物，通过测定不同微粒体蛋白浓度和不同孵育时间的探针代谢物对乙酰氨基酚及4-羟基双氯酚酸的生成量，确定大鼠、Beagle犬和人肝微粒体体外最佳孵育条件。设酮康唑组（0.01，0.1，1，10和100μmol.L-1）及空白对照组，分别加入浓度为5μmol.L-1的丙酸睾酮至孵育系统。测各组丙酸睾酮的代谢物6β-羟基睾酮的生成量，计算半数抑制浓度（IC50）评价酮康唑对CYP3A4的抑制作用。取大鼠、犬和人微粒体，均分成CPUHY002组（0.01，0.1，1，10μmol.L-1，100μmol.L-1）及空白对照组。加入浓度分别为10/100/5/2.5/20/5μ mol.L-1的非那西丁/双氯酚酸钠/奥美拉唑/右美沙芬/氯唑沙宗/丙酸睾酮至孵育系统一起反应，测定各探针代谢产物对乙酰氨基酚/4-羟基双氯酚酸/5-羟基奥美拉唑/右啡烷/6-羟基氯唑沙宗/6β-羟基睾酮的生成量。以对照组酶活性为参照，求算CPUH Y002组CYPlA2，CYP2C9， CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4和CYP2E1的剩余C YP酶活性百分率，计算CPUHY002对各同工酶的IC50。
　　结果：探针代谢物方法学验证结果表明微粒体中内源性物质不干扰探针药物及内标的检测，探针代谢物对乙酰氨基酚/右啡烷/6β-羟基睾酮/4-羟基双氯酚酸/5-羟基奥美拉唑/6-羟基氯唑沙宗标准曲线浓度在28.938/31.250/125.000/1.953/3.125/7.813~1852.000/2000.000/8000.000/125.000/200.000/500.000ng/ml之间标准曲线线性关系良好，相关系数（r）均大于0.990；定量下限分别为28.938/31.250/125.000/1.953/3.125和7.813；批间精密度和准确度相对标准偏差（RSD）均小于15％，回收率均大于70%，重复性好，而且各个探针代谢物低中高浓度回收率相近，提取回收率呈非浓度依赖性。基质效应在90%~110%之间，说明基质对探针代谢物无抑制作用。4℃冰箱冷藏4h的稳定性良好。肝微粒体孵育系统中，微粒体蛋白浓度在0.5mg/ml，孵育时间为10、20和30min时，成良好的线性关系，且在30min代谢物生成量最大。最终选择微粒体蛋白浓度为0.5mg/ml，孵育30min作为孵育系统的最佳孵育条件。酮康唑在大鼠、Beagle犬和人肝微粒体中对CYP3A4抑制的IC50值分别为0.495、0.220和0.225μmol.L-1，呈现出对CYP3A4的强抑制作用。证明了本研究建立的大鼠、犬、人肝微粒体体外孵育系统的可行性和可靠性。CPUHY002对大鼠、Beagle犬和人肝微粒体CYP2C19的IC50值分别为27.62、44.76和48.02μmol.L-1；CPUHY002对大鼠、Beagle犬和人肝微粒体CYP2E1的IC50值分别为20.72、22.74和47.19μ mol.L-1；CPUHY002对大鼠、Beagle犬和人肝微粒体CYPlA2、CYP2D6、CYP3A4和 CYP2C9的IC50值均大于100μmol.L-1。在大鼠和犬肝微粒体之间、大鼠和人肝微粒体之间CPUHY002对CYP2C19抑制的IC50值比较有显著差异（P<0.05）。而犬和人肝微粒体之间CPUHY002对CYP2C19抑制的IC50无差异。CPUHY002在大鼠和人肝微粒体之间、犬和人肝微粒体之间对CYP2E1抑制的IC50值比较有显著差异（P<0.05），而犬和鼠肝微粒体之间CPUHY002对CYP2E1抑制的IC50无差异。
　　结论： CPUHY002对大鼠、Beagle犬和人肝微粒体CYP2C19和CYP2E1具有弱抑制作用，对大鼠、Beagle犬和人肝微粒体CYPlA2、CYP2D6、CYP3A4和CYP2C9均没有抑制作用；CPUHY002对大鼠、Beagle犬、人肝微粒体CYP450同工酶CYP2E1、CYP2C19的体外抑制作用存在种属间差异。

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中文摘要

英文摘要

1、引 言

2、材料与方法

2.1材料、试剂及仪器

2.2 方法

2.3统计学处理

3、结果

3.1 大鼠肝微粒体中探针代谢物测定的方法学结果

3.2 犬肝微粒体中探针代谢物测定的方法学结果

3.3 人肝微粒体中探针代谢物测定的方法学结果

3.4 孵育系统条件的优化

3.5酮康唑对CYP3A4酶活性的影响

3.6微粒体样品测定过程中的随行标准曲线及质量控制

3.7 CPUHY002对大鼠、犬和人肝微粒体CYP450同工酶活性的影响

3.8 CPUHY002对大鼠、犬和人肝微粒体CYP450同工酶体外抑制作用的种属差异

4、讨论

5、结论

参考文献

致谢

四、附录

附录A英中文术语和缩略语对照表

附录B个人简介

附录C攻读硕士学位期间发表文章情况

附录D 综述: 细胞色素P450同工酶在心血管系统药物代谢中作用的研究进展