紫菀化学成分表征与分析及表木栓醇对人肝微粒体CYP450酶抑制作用研究

摘要

紫菀为菊科多年生草本植物紫菀（Aster tataricus L. f.）的干燥根及根茎，是我国传统医药中常用中药材，中医临床应用主要为祛痰镇咳，是许多常用止咳平喘复方中药制剂中主要组成的药味之一。紫菀所含化学成分丰富，其主要类型包括萜类、黄酮、香豆素、有机酸、甾醇和挥发油等物质。有研究表明，从紫菀中分离出的紫菀酮和表木栓醇为发挥祛痰镇咳的主要成分。现代药理学研究表明，紫菀属植物不单有止咳化痰、宣肺平喘的作用，还具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化活性。此外，有临床报道证实紫菀还具有利尿通便之功效。本研究旨在建立超高效液相色谱-质谱联用方法对紫菀提取物进行多组分鉴定、分析及含量测定。同时建立体外肝微粒体孵育体系，通过测定人肝微粒体中探针药物代谢产物的含量，计算抑制剂的IC50值，从而评价紫菀中主要祛痰成分表木栓醇对细胞色素P450酶的抑制作用。本研究分为三个部分：
　　第一部分：UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定紫菀中15种化学成分。
　　目的：建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法，对紫菀提取物中三萜类、黄酮类及香豆素类化合物进行快速分离和成分鉴定。
　　方法：首先通过电喷雾离子源正、负离子一级质谱扫描、母离子扫描和子离子扫描，研究紫菀中11个化学成分对照品的质谱裂解途径，并总结其裂解规律。进而对紫菀提取物进行 TOF-MS-IDA-8MS/MS扫描，应用数据处理系统Peak View2.0软件中MasterView分析模块，获得化合物的精确分子质量、元素组成和一级、二级质谱图，筛选和鉴定紫菀中的化学成分。色谱条件：Agilent Poroshell120 EC-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm）。流动相：A为0.1％甲酸-水缓冲溶液，B为0.1%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱。流速：0.4 mL/min。进样量：2μL。
　　结果：通过电喷雾离子源正离子一级质谱扫描、母离子扫描和子离子扫描，推测出紫菀中11种化学成分（包括4个三萜类、5个黄酮类和2个香豆素类化合物）的质谱裂解途径。采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定出紫菀提取物的15种化学成分（包括4个三萜类、8个黄酮及其苷类和3香豆素类），其中11个化合物通过与对照品比对，可确证其化学结构，其余4个化合物通过分析MasterView模式提供的质谱碎片信息可被推测及鉴定，误差范围在±5 ppm之内。
　　结论：UHPLC-Q-TOF-MS/MS法灵敏度高、准确度好、操作简便、快捷，为紫菀成分分析与质量控制研究提供理论依据和技术支持。
　　第二部分：UPLC-MS法同时测定紫菀药材中5种化学成分的含量。
　　目的：建立UPLC-MS/MS方法同时测定紫菀中紫菀酮、木犀草素、槲皮素、山奈酚、阿魏酸的含量。
　　方法：采用Waters BEH C18（5 mm×2.1 mm，1.7μm）色谱柱，以0.1%的甲酸乙腈（A）-水（B）溶液为流动相进行梯度洗脱（0-3 min，5%-45%A；3-10 min，95%-95%A），体积流量0.3 mL/min，进样量10μL，柱温40℃；采用电喷雾离子源进行正、负离子模式同时监测，多反应监测模式（MRM）用于定量分析。
　　结果：5种成分的峰面积和浓度在测定浓度范围内均具有良好的线性关系，加样回收率为97.32%-102.0%，精密度RSD值为1.51%-2.99%，稳定性良好。6批样品中紫菀酮、木犀草素、槲皮素、山奈酚、阿魏酸的含量依次为2.69-4.64、2.22×10-2-1.04×10-1、3.68×10-4-2.08×10-3、0.12-0.30、5.16×10-3-2.18×10-2 mg/g。
　　结论：该方法简便、准确、灵敏度高、重现性好，可用于紫菀中紫菀酮、木犀草素、槲皮素、山奈酚和阿魏酸的含量测定。
　　第三部分：表木栓醇对人肝微粒体CYP3A4、2C9和2C19酶的抑制作用。
　　目的：采用探针底物法研究紫菀中主要成分表木栓醇对人肝微粒体CYP3A4、2C9和2C19酶的抑制作用。
　　方法：建立人肝微粒体体外孵育体系，以不同浓度表木栓醇为抑制剂，选取CYP3A4、2C9和2C19酶的特异性探针药物，采用UHPLC-MS/MS法测定探针底物生成的代谢产物含量，计算表木栓醇IC50值。
　　结果：表木栓醇对CYP3A4、2C9、2C19酶的IC50值依次为113.8、1.336、340.5μmol/L。即表木栓醇对于3A4和2C19抑制作用微弱，而对于2C9表现出中等程度的抑制作用。
　　结论：本研究建立的探针底物孵育法，可用于预测表木栓醇对人肝微粒体中CYP3A4、2C9、2C19酶活性的抑制作用，为研究药物-药物相互作用及临床合理配伍用药提供科学依据。

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引言

第一部分UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定紫菀中15种化学成分

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分UPLC-MS法同时测定紫菀药材中5种化学成分的含量

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分表木栓醇对人肝微粒体CYP3A4、2C9和2C19酶的抑制作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:中药紫菀的研究概况与进展

致谢

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