甘蔗己糖转运蛋白基因启动子pPST2a的功能研究

摘要

启动子是基因表达调控的重要元件。在转基因植物中,启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一,选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。组成型启动子,在转基因植物的研究中得到了广泛运用。但是组成型启动子不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达,在作物的遗传改良中存在一定的缺陷。组织特异启动子作为一类专一性启动子,能指导外源基因在植物发育过程中某一特定时空表达,它不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累,增加区域表达量,避免植物营养的浪费。因此,寻找一个在甘蔗中高效表达或者特异的启动子,对甘蔗遗传改良有重要义。
　　 本实验室克隆了甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a基因5'上游1968bp的启动子序列,命名为pPST2a。为了进一步鉴定它的功能,我们构建了它一系列的缺失表达载体:pCBI1900、pCBI1600、pCBI1300、pCBI1100;又通过农杆菌介导法对甘蔗进行了遗传转化并获得一批转化植株;对这些转化植株分别进行了GUS基因的PCR检测,证实获得转pCBI1900、pCBI1600、pCBI1300和pCBI1100的阳性植株分别为16、33、29、和21株;从每个载体获得的转基因植株中,选出生长良好的,进行根、茎、叶、叶芽、叶鞘、五个部位的GUS基因表达的检测(GUS组织化学染色定位法),证明GUS基因在转pCBI1900、pCBI1600和pCBI1300植株中的根部均有表达,而其余部位未见其表达;转pCBI1100植株中,任何部位均没有表达;证明了pCBI1900、pCBI1600、pCBI1300具有根部特异表达的活性。说明pPST2a具有甘蔗根特异表达的特性。为了进一步研究此启动子在其它植株中的表达特性,我们又利用农杆菌介导法把它们转入烟草,经GUS基因PCR鉴定,获得27株转pCBI1900和33株转pCBI1600的阳性植株,对转基因烟草的进一步研究还在进行之中。

目录

文摘

英文文摘

1 引言与文献综述

1.1 甘蔗概况

1.1.1 甘蔗在农业生产中的重要性

1.1.2 甘蔗的主要用途

1.1.3 甘蔗副产品的用途

1.1.4 甘蔗在生物领域作为转基因受体的优点

1.2 植物基因启动子的研究

1.2.1 植物基因启动子性质

1.2.2 组成型启动子

1.2.3 组织特异性启动子

1.2.4 诱导型启动子

1.2.5 植物基因启动子的人工改造及运用前景

1.3 甘蔗启动子的研究

1.3.1 甘蔗启动子研究的重要意义

1.3.2 甘蔗的启动子的研究进展.

1.4 甘蔗遗传转化的方法

1.4.1 农杆菌介导法

1.5 本论文研究的目的、内容和技术路线

1.5.1 研究目的

1.5.2 研究内容

1.5.3 技术路线

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 植物材料

2.1.2 质粒及菌种

2.1.3 试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 PCR引物

2.2 常用药品、培养基及其试剂的配制

2.2.1 培养基配制

2.2.2 溶液配制

2.3 实验所用试剂配制

2.3.1 总DNA提取

2.3.2 质粒DNA提取

2.3.3 GUS组织化学染色试剂

2.4 实验方法

2.4.1 PST2A基因启动子系列缺失及缺失表达载体的构建

2.4.2 缺失表达载体的构建

2.4.3 PCBI1900、PCBI1600、PCBI1300、PCBI1100植物表达载体转化农杆菌

2.4.4 菌株鉴定

2.5 PCBI1900、PCBI1600、PCBI1300、PCBI1100表达载体遗传转化甘蔗

2.5.1 甘蔗转化材料及其农杆菌菌液的准备

2.5.2 农杆菌菌液浸染愈伤组织

2.5.3 侵染后愈伤组织的共培养及洗涤

2.5.4 预检测侵染效率

2.5.5 浸染后的愈伤组织分化

2.5.6 甘蔗植株的筛选培养

2.5.7 甘蔗抗性小苗的定植

2.6 抗性甘蔗植株的PCR检测

2.6.1 甘蔗总DNA的小量提取

2.6.2 转化甘蔗的GUS基因PCR检测

2.7 转PCBI1900、PCBI1600、PCBI1300、PCBI1100植株GUS组织化学染色结果

2.8 PCBI1900 PCBI1600表达载体遗传转化烟草

2.8.1 烟草转化材料及其农杆菌菌液的准备

2.8.2 农杆菌介导法转化烟草

2.8.3 侵染后烟草叶片的共培养

2.8.4 浸染后的烟草叶片组织分化

2.8.5 烟草的筛选培养

2.8.6 烟草抗性小苗的定植

2.9 抗性烟草植株的PCR检测

2.9.1 烟草总DNA的小量提取

2.9.2 转化植株的PCR检测

3 结果与分析

3.1 PST2A基因启动子系列缺失及缺失表达载体的构建

3.1.1 PST2A基因启动子系列缺失

3.1.2 各表达载体的构建

3.2 PCBI1900、PCBI1600、PCBI1300、PCBI1100植物表达载体的农杆菌转化和鉴定

3.2.1 植物表达载体PCR鉴定

3.2.2 植物表达载体的酶切鉴定

3.3 农杆菌介导的甘蔗转化

3.3.1 农杆菌介导法转化甘蔗愈伤组织及甘蔗小苗分化与筛选过程

3.4 转化甘蔗植株的分子检测

3.4.1 PCR检测

3.5 GUS组织化学染色

3.6 农杆菌叶盘法遗传转化烟草

3.7 烟草的PCR检测

3.7.1 烟草DNA的提取

3.7.2 转PCBI1900抗性植株的GUS基因PCR检测

3.7.3 转PCBI1600抗性植株的GUS基因PCR检测

4 讨论

4.1 有关甘蔗抗性苗的转化效率和检测

4.2 关于根部特异启动子

4.3 关于GUS报告基因和检测

5.结论

6.本试验研究的后续工作

7.参考文献:

8.论文说明:缩写词

致谢