木薯耐寒相关microRNA的差异表达分析

摘要

MicroRNA(miRNA)是一类～22nt的非编码小分子RNA,通过转录后水平上抑制或降解靶基因mRNA来调节基因表达。miRNA涉及几乎所有重要的生物学过程,包括对发育、细胞增殖和凋亡、胁迫响应等方面的调控。木薯为典型的热带能源作物,研究其耐低温的分子机制是进行木薯抗寒性遗传改良的重要的基础性工作。
　　 本研究利用实时定量PCR(quantitative Real Time-PCR)分析23个抗寒候选miRNA在木薯品种C4和KU50正常生长下及低温胁迫处理下的表达差异,并对这些miRNA进行相应的靶基因预测。具体结果如下:
　　 1.系统建立并完成了木薯低温适应的生物学过程,摸索出表达分析的时间序列点和取样方法,为木薯973项目抗寒机制研究部分建立了物质基础。
　　 2.对23个抗寒候选miRNA(19条引物)的表达分析表明,在未处理对照下相对于内参U6除miR5178028,miR1045125和miRl717290低表达或不表达外,其余20个miRNA均表达,且在不同器官中有表达差异。
　　 3.23个抗寒候选miRNA中,低温诱导AT下上调表达有:mi156a,,399e,1045125,4367213,1717290,6915202等6个miRNA;下调表达有:miR166a,,171 a,b,157b,390b,166b,c,d,e,6915202等10个miRNA。这些miRNA将是进一步发掘木薯耐低温调节机制的重要基因资源。此外,23个miRNA中,在诱导后寒害.AH下,有9个miRNA上调6个下调表达;非诱导寒害NAH下,有6个miRNA上调4个下调表达。预示着它们在木薯中蕴含不同耐寒调节机制,后续研究中值得关注。
　　 4.低温诱导.AT下有20个miRNA在木薯C4叶和根中表现出不同的表达模式,17个miRNA在木薯KU50不同器官中表现出不同的表达模式;诱导后寒害AH下,23个抗寒候选miRNA中有19个miRNA在C4叶和根中表现出不同的表达模式,KU50中有19个;而在非诱导直接寒害NAH下,23个抗寒候选miRNA中有17个miRNA在C4的不同器官中表现出不同的表达模式,有19个miRNA在KU50中表达不同。表明这些miRNA.表达存在基因型和器官的差异性,说明不同品种(组织)中可能存在不同miRNA调节的耐低温基因。
　　 5.通过Hitsensor软件预测出23个miRNA在木薯中所作用的相关靶基因,建立180对miRNA与靶基因的互作对。其中低温诱导下表达的15个miRNA靶向的靶基因非常有意义,将是后续研究的重点。
　　 本研究在木薯中进一步收集与低温胁迫相关的miRNA及其靶基因,这些研究成果为今后木薯耐寒育种研究提供了重要的基因资源。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 木薯是重要的能源作物

1.2 植物的抗寒研究机理

1.2.1 植物低温生理生化变化

1.2.2 植物的抗寒基因的表达及调控

1.2.3 低温信号转导

1.2.4 低温逆境蛋白

1.3 miRNA研究进展

1.3.1 miRNA的分子机制

1.3.2 miRNA的研究方法

1.3.3 植物miRNA数据库

1.3.4 植物miRNA功能

1.4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 植物的材料及其低温处理

2.2 主要仪器及试剂

2.2.1 主要仪器

2.2.2 试剂与试剂盒

2.3 miRNA差异表达分析

2.3.1 miRNA获取

2.3.2 miRNA引物设计

2.3.3 miRNA的提取

2.3.4 miRNA 3'末端加Poly(A)

2.3.5 cDNA第一链的合成

2.3.6 RT-PCR检测

2.3.7 实时定量PCR对miRNA进行相对定量分析

2.4 miRNA靶基因预测

3 结果与分析

3.1 木薯品系的低温胁迫反应

3.2 small RNA检测及qRT-PCR检测

3.2.1 small RNA质控检测及PCR反应体系优化

3.2.2 qRT-PCR检测

3.3 miRNA表达水平分析

3.3.1 未处理对照下miRNA表达水平

3.3.2 低温胁迫下miRNA表达水平

3.4 不同胁迫过程中miRNA的差异表达

3.4.1 在未处理对照下miRNA的表达

3.4.2 在低温胁迫下miRNA的表达

3.4.3 未处理对照和低温胁迫下miRNA的表达异同

小结

3.5 不同胁迫过程中miRNA的表达模式

3.5.1 miRNA表达模式的确定

3.5.2 miRNA表达模式

小结

3.6 木薯低温胁迫miRNA的靶基因预测

4 讨论

4.1 低温胁迫处理及表达模式分类的可行性评价

4.2 植物耐低温miRNA与抗寒性关联性

4.3 植物miRNA的组织特异性

4.4 植物miRNA的功能

4.5 植物miRNA及其靶基因

5 结论

参考文献

附录1 苗期培养营养液配制

附录2 胁迫处理下23个miRNA的表达水平总结

附录3 预测得到的12个miRNA在蓖麻编码区中互作的42对标靶基因及主要功能

附录4 测序得到的11个miRNA在拟南芥编码区中互作的138对标靶基因及主要功能

研究生期间发表的论文情况

致谢