变形链球菌pacA和gtfB-cat与ctxB嵌合表达质粒的构建及其原核表达

摘要

龋病被认为是一种细菌感染性疾病，严重影响着人类健康，其中变形链球菌是最主要的致龋菌之一。多年来，学者们一直尝试用免疫学的方法来预防龋病，期望通过主动免疫或被动免疫来阻止致龋菌对宿主口腔的粘附与定殖，从而减少龋齿的发生。目前，利用转基因植物来生产疫苗的研究日益深入，转基因植物疫苗能够通过直接口服的给药方式诱导动物和人体的粘膜和系统免疫应答，具有安全、有效、廉价和方便等优点，显示出较为广阔的应用前景和潜在的经济效益。 本研究旨在构建含变形链球菌中富集T、B细胞表位的表面蛋白氨基端A区的编码基因pacA、葡糖基转移酶催化区的编码基因gtfB-cat及粘膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位的编码基因ctxB嵌合表达质粒的转基因植物疫苗，并证实其在大肠杆菌中正确表达，为可食嵌合体防龋疫苗的研究打下基础。 方法：实验共分两部分： 第一部分变形链球菌pacA和gtfB-cat与ctxB嵌合表达质粒的构建 1.以质粒pcDNA3-pac、pET-gtfB、pBS-ctxB为模板，设计合成引物，获得目的基因pacA、gtfB-cat、ctxB； 2.通过T-A克隆构建中间载体T-pacA、T-cat、T-ctxB； 3.T-ctxB及原核克隆载体pET32-a(+)经EcoRJ和-ghoⅠ双酶切后连接，构建质粒pET-ctxB；T-pacA及pET-ctxB经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切后连接，构建质粒pET-pacA-ctxB；T-cat及pET-pacA-ctxB经BamHI和EcoRI双酶切后连接，构建质粒pET-pacA-cat-ctxB。 第二部分重组质粒pET-pacA-cat-ctxB的原核表达 将重组质粒pET-pacA-cat-ctxB转入表达宿主菌EcoliBL21(DE3)，通过IPTG化学诱导的方法表达目的蛋白。 结果：构建的重组质粒pET-pacA-cat-ctxB经酶切、PCR鉴定及测序证实目的基因pacA、gtfB-cat和ctxB均正确插入到载体pET-32a(+)中，插入的相位正确，未改变目的基因的阅读框架。重组质粒pET-pacA-cat-ctxB转化至Ecoli BL21(DE3)，经IPTG诱导后表达目的蛋白，分子量大小与预期一致。 结论：成功构建了变形链球菌PAc A区编码基因和GTFs CAI区编码基因及粘膜免疫佐剂CTB编码基因的嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB，并能在原核细胞内正确表达。

目录

论文说明：主要英文缩略词

摘要

前言

第一部分 变形链球菌pacA和gtfB-cat与ctxB嵌合表达质粒的构建

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分 重组质粒pET-pacA-cat-ctxB的原核表达

材料和方法

结果

讨论

小结

全文总结

参考文献

综述 免疫佐剂在防龋疫苗研究中的应用

致谢