液相-SELEX方法的建立及变形链球菌葡糖基转移酶催化区特异适配体的筛选

摘要

葡糖基转移酶(Glucosyltransferase，GTF)是变形链球菌合成的重要致龋因子，催化蔗糖合成包括葡聚糖在内的多种胞外多糖。GTF结构包括催化区(Catalytic，CAT)和葡聚糖结合区(Glucan binding，GB或GLU)两个功能区段，其中催化区(CAT)是它的重要功能区段。
　　 本实验首先利用基因工程的方法在大肠杆菌中分别诱导表达了带NusA的rNusA-CAT融合蛋白和NusA对照蛋白。菌体经超声破碎后，重组蛋白存在于菌体超声上清液中。利用载体上C端的His标签对重组蛋白进行了金属螯合层析纯化。蒽酮-硫酸法证明重组rNusA-CAT蛋白具有良好的催化活性。
　　 由于传统SELEX技术筛选靶分子时，首先需要将靶分子进行纯化和固定，因而以天然构象存在于液相中的非纯化靶蛋白不能通过传统的方法进行筛选。为解决这一问题，本研究将凝胶阻滞(EMSA)的基本原理引入消减SELEX筛选过程，初步建立了一种基于凝胶阻滞的新筛选方法，实现了非纯化靶标蛋白的液相筛选(液相-SELEX技术)。实验采用随机区为35个碱基、全长78nt的ssDNA文库，以表达rNusA-CAT蛋白的未纯化上清为目的靶，以表达NusA蛋白的未纯化上清为消减靶，利用液相-SELEX技术进行了十轮的筛选。放射性同位素检测发现；随着筛选轮次的增加，ssDNA文库逐渐富集，富集的ssDNA配基可特异的识别rNusA-CAT蛋白，而不识别NusA蛋白。该结果的取得为今后GTF功能抑制剂的获得和龋齿病防治奠定基础。
　　 液相-SELEX技术的建立实现了非纯化的、天然构象蛋白的筛选，为今后以病人血清、唾液、体液等作为筛选靶标，快速、有效地获得疾病的血清或体液标志物及分子探针提供一种新的技术方法，从而为疾病的诊断和治疗带来新的思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词汇

声明

第1章绪论

1.1 SELEX技术的原理和优势

1.2 SELEX技术的研究进展及应用

1.3实验的工作基础和问题

1.4研究思路

1.5实验流程

第2章重组rNusA-CAT蛋白与NusA蛋白的可溶性表达与纯化

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4讨论

小结

第3章液相-SELEX方法的建立及变形链球菌葡糖基转移酶催化区特异性适配体的筛选

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4讨论

小结

全文总结

参考文献

致谢

附录A：攻读学位期间所发表的学术论文目录