PCR技术应用于啤酒腐败菌的快速检测

摘要

在啤酒厂，啤酒腐败菌是指那些对啤酒品质造成危害、破坏啤酒风味及生物稳定性的一类兼性或严格厌氧微生物。而细菌通常是一类革兰氏染色呈阳性、过氧化氢酶呈阴性的产乳酸菌。啤酒中污染菌是啤酒生产中出现的一种生物污染。目前，啤酒厂对啤酒腐败菌的检测方法是将样品膜过滤后，把膜放在琼脂培养基表面或液体培养基中，在厌氧环境中培养，根据菌株在培养基中生长情况，如生长速度，菌落形态，特殊的生理反应（如特殊底物的显色反应），是否产孢子以及是否出现混浊等来检测样品中的活菌。对啤酒腐败菌的检测至少需花费5～7d，而对林氏乳杆菌的检测则至少需要7d，甚至更长。要解决啤酒腐败菌检测手段远远滞后于生产的矛盾，就必须研究其快速检测技术。准确、快速地检测和鉴定出啤酒中的污染菌不仅能保证啤酒品质，还体现出啤酒企业所具有的高技术水平。随着现代生物技术的发展，污染菌的检测方法也有所提高，目前研究较多的快速检测方法包括ATP检测方法、免疫学的检测方法、分子生物学检测方法等。
　　 本实验在前人工作的基础上，利用聚合酶链式反应(PCR)技术快速、灵敏检测啤酒腐败菌的方法，可在数小时内，将靶序列特异性扩增至百万倍以上，达到检测目的。
　　 本研究主要内容是利用选择性培养基分离纯化出5种腐败菌，根据细菌形态把它们分别编号为G9181、G9182、G9251、G9252、G9253。通过API50CHL鉴定试剂条把它们分别鉴定为短乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌。以鉴定的短乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌的DNA为模板，根据核糖体DNA(16SrDNA)的高度保守区设计通用引物，使得该引物可以同时扩增出上述三种菌的扩增产物。旨在设计出合理的种特异性通用引物，然后对所设计引物进行扩增条件的优化，最终确定设计出引物的最适扩增条件。以短乳杆菌为实验对象，对其进行预增菌、模板提取、PCR扩增等条件的优化。
　　 通过研究，得到了以下结论：
　　 1、对啤酒中污染菌进行分离、纯化，通过一系列生理生化反应以及API50CHL试剂条菌种鉴定后，结果显示啤酒中的污染菌为短乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌。
　　 2、预增菌，研究了培养基优化，比较了MRS培养基以及改良的MRS1培养基（将葡萄糖分别换成可溶性淀粉、菊粉）对于菌种培养的影响。结果表明菊粉对乳酸菌生长有一定的促进作用。PCR检测短乳杆菌灵敏度达到18个CFU/mL，由于乳酸菌细胞排列为单个、成双和成束，而成束的细胞可高达10个，因此推测PCR检测的灵敏度可达18～180个CFU/mL。
　　 当细胞初始浓度为10CFU/mL，经过用MRS1对菌体进行细胞富集培养，增殖所需要的时间为24～30h。加上样品制备、模板提取、PCR扩增及电泳观察所需的时间8h，检测有害菌株总需时32～38h，比传统平板培养法缩短3～5d，大大提高了检测效率。
　　 3、模板提取，研究了CTAB法、煮沸法、溶菌酶法、蛋白酶K法、溶菌酶及蛋白酶K混合酶裂解煮沸制备的模板DNA直接电泳和用以PCR扩增的结果。
　　 PCR结果同样表明，CTAB法、溶菌酶及蛋白酶K混合酶裂解煮沸法均能得到目的产物片段，但CTAB法相对提取模板时间较长，溶菌酶及蛋白酶K混合酶裂解煮沸法提取效果与CTAB法基本相同，且提取时间较短，因此可选溶菌酶及蛋白酶K混合酶裂解煮沸法提取模板。
　　 4、改进的25μlPCR优化体系：Taq酶用量2.0U/ml，Mg2+浓度2.0mM，退火温度为50℃。扩增程序：94℃4min进入循环，94℃30s，50℃30s，72℃30s，35个循环后，再72℃下延伸5min。
　　 5、PCR优化后的体系对5株标准菌（短乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌、奶酪乳杆菌、乳酸乳球菌）与分离到的3株腐败菌（短乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌）的PCR结果进行了比较。结果显示3株腐败菌（短乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌）与相应的3株标准菌（短乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌）均可以扩增出产物。而其它两株标准菌（奶酪乳杆菌、乳酸乳球菌）无扩增结果。

目录

文摘

英文文摘

插图（表）索引

略缩词

第一章 文献综述

1.1 啤酒及啤酒工业的发展

1.1.1 啤酒的历史

1.1.2 啤酒的工业现状

1.2 影响啤酒质量的因素及检测与鉴定方法的研究进展

1.2.1 啤酒生产工艺

1.2.2 啤酒质量指标

1.2.3 啤酒腐败菌污染啤酒的原理

1.2.4 检测与鉴定方法的研究进展

1.3 PCR技术概述

1.3.1 PCR概述

1.3.2 PCR基本原理

1.3.3 PCR反应体系

1.3.4 PCR循环参数

1.4 PCR技术在啤酒工业中检测啤酒腐败茵概述

1.4.1 使用一套特异引物的PCR技术

1.4.2 RAPD-PCR（随机扩增多态DNA分析多聚酶链反应技术）

1.4.3 Nested-PCR（嵌套多聚酶链反应技术）

1.4.4 PCR技术在啤酒腐败菌鉴定中的发展动向

1.5 本课题的目的和意义

第二章 啤酒中腐败菌的分离、纯化

2.1 引言

2.2 实验材料和设备

2.2.1 实验材料

2.2.2 培养基和试剂

2.2.3 仪器和设备

2.3 实验方法

2.3.1 过氧化氢酶反皮实验

2.3.2 氢氧化钾实验

2.3.3 革兰氏染色

2.3.4 明胶液化实验

2.3.5 结合稀释涂布平板法和选择性培养基分离纯化细菌

2.3.6 API50CHL菌种鉴定

2.4 结果与讨论

2.4.1 结果

2.4.2 讨论

2.5 结论

第三章 啤酒腐败菌预增菌的研究

3.1 引言

3.2 实验材料和设备

3.2.1 实验材料

3.2.2 培养基和试剂

3.2.3 仪器和设备

3.3 实验方法

3.3.1 菌株在不同培养基下的生长状况

3.3.2 菌株在不同温度下的生长状况

3.3.3 菌株在不同PH值下的生长状况

3.3.4 预增菌PCR扩增灵敏度的检测

3.3.5 啤酒有害菌的快速鉴定

3.4 结果与讨论

3.4.1 结果

3.4.2 讨论

3.5 结论

第四章 PCR法检测啤酒腐败菌模板制备方法研究

4.1 引言

4.2 实验材料和设备

4.2.1 实验材料与主要试剂

4.2.2 实验设备

4.3 实验方法

4.3.1 模板制备方法

4.4 结果与讨论

4.4.1 结果

4.4.2. 讨论

4.5 结论

第五章 PCR法检测啤酒腐败菌条件的优化

5.1 引言

5.2 实验材料与设备

5.2.1 实验材料与主要试剂

5.2.2 仪器和设备

5.3 实验方法

5.3.1 模板制备

5.3.2 引物设计

5.3.3 PCR体系优化(25μl)

5.4 结果与讨论

5.4.1 结果

5.4.2 讨论

5.5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文