三种药用植物内生真菌及一种藏药次级代谢产物的生物活性研究

摘要

本论文对藏药唐冲那保（药学植物名为山莨菪（Anisodus tangutcus））总生物碱进行抗乙酰胆碱酯酶活性跟踪分离的研究及三种药用植物中的三株内生真菌的次级代谢产物进行化学成分和生物活性研究。运用多种现代色谱（硅胶柱色谱法，制备薄层色谱法，凝胶色谱等）分离技术，并借助1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS波谱方法分离、鉴定了16个化合物，其中从藏药唐冲那保总生物碱提取物中跟踪分离得到3个托品烷及1个吡咯烷类生物碱，从半夏(Pinellia ternate(Thunb.)Breit)内生菌BX-9中分离到7个化合物，从狼毒（Stellera chamaefasme）内生真菌LD-3中分离得到4个化合物，从雷公藤（Tripterygium wil fordii）内生真菌LGT-3中分离得到7个化合物。对分得的化合物进行了抗乙酰胆碱酯酶、单胺氧化酶及抗肿瘤活性研究。研究结果如下:
　　1.从山莨菪中分离鉴定的生物碱为:scopolamine(1)，anisodine(2)，cuscohygrine(3)，atropine(4)。采用改良的Ellman法测定了其抗乙酰胆碱酯酶活性，研究表明:在终浓度为100μg/ml时，它们的抑制率分别为45.28％，38.08％，47.56％，25.10％。
　　2.从半夏内生菌BX-9菌丝体和发酵液中分离纯化得到7个单体化合物，鉴定为:2-Hydroxy-14-tricosenvic acid(5)，4，6，8(14)，22(23)-四烯-3-酮-麦角甾烷[4，6，8(14)22(23)-tetraen-3-one-ergostane](6),Ergosterol(7),Ergosterol peroxide(8),(+)-BrefeldinA(9)，7-oxo-brefeldin A(10)，4-epi-Brefeldin A(11)。采用改良的Ellman法和MTT法对7个化合物的生物活性进行测定，研究结果表明:化合物10有一定的抗AChE活性，终浓度为100μg/mL时抑制率为42.24％，化合物(7-10)对三株肿瘤细胞Hela，7721，HL60均有显著活性，其中化合物8和10在50μg/mL时，HL-60细胞无存活，化合物(7-10)的浓度在50μg/mL时，Hela细胞的存活率都小于10％，当化合物(8-10)浓度在20μg/mL时，Hela细胞的存活率仍小于30％。
　　3.从狼毒内生菌LD-3菌丝体甲醇提取物中分离得到4个单体化合物，鉴定为:2-Hydroxy-14-tricosenvic acid(5)，4，6，8(14)，22(23)-四烯-3-酮-麦角甾烷[4,6,8(14)-22(23)-tetraen-3-one-ergostane](6),Ergosterol(7),Ergosterol peroxide(8)。
　　4.从雷公藤内生菌LGT-3的发酵液中分离纯化得到7个单体化合物，鉴定为:Ergosterol(7),Ergosterol peroxide(8),trihydroxytetralone(12),Aspterric acid(13),4-(2-hydroxy-3-butyn-lenoxy)benzoic acid(14),FructigeninesB(15),brevicompanine B(16)。其中化合物7，8为甾体类，化合物12为四氢萘酮类，化合物13，14为羧酸类，化合物15，16为二酮哌嗪生物碱类化合物。以上化合物生物活性研究表明:化合物12，15，16有一定的抗AChE活性，在终浓度为100μg/mL抑制率分别为45.33，41.95，47.08％;化合物12，14具有中等强度的单胺氧化酶抑制活性，其抑制率分别为60.58，65.81％;化合物15，16在终浓度50μg/mL时，HL60细胞的存活率小于10％。
　　5.运用分子生物学手段，对菌株BX-9、LD-3及LGT-3的rDNA的ITS序列区核酸进行序列分析，并在Blast上与其同源度较高的ITS rDNA序列进行比对，通过聚类分析，以及结合菌落形态颜色及菌丝体、分生孢子梗的观察，鉴定内生真菌BX-9和LD-3菌株均为半知菌类丛梗孢目丛梗孢科的青霉属（Penicillium sp.）真菌，LGT-3为喙枝孢属（Rhinocladiella sp.）真菌。
　　本论文从一种植物及三株内生真菌中分离鉴定了16个化合物，对其抗乙酰胆碱酯酶，单胺氧化酶及抗肿瘤生物活性进行了研究，发现化合物7，8，9，10，15，16具有强抗肿瘤活性，其分别为甾体类，大环内酯类，二酮哌嗪生物碱类化合物。文献报道二酮哌嗪生物碱类化合物具有植物生长的调节功能，但目前为止，未见化合物FructigeninesB(15)，brevicompanine B(16)的抗肿瘤活性报道。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 山莨菪属植物化学成分及生物活性研究概况

1．1．1 山莨菪属植物研究现状

1．1．2 山莨菪属植物化学成分研究

1．1．3 山莨菪属植物生物活性研究概况

1．2 药用植物内生真菌研究概况

1．2．1 黄酮类化合物

1．2．2 甾体类化合物

1．2．3 环肽类化合物

1．2．4 醌类化合物

1．2．5 苯丙素类化合物

1．2．6 萜类化合物

1．2．7 生物碱类化合物

1．2．8 酯类化合物

1．2．9 有机酸类化合物

1．2．10 其他类化合物

1．3 小结

1．4 三种药用植物内生真菌研究现状

1．4．1 药用植物半夏内生真菌次级代谢产物研究现状

1．4．2 药用植物狼毒内生真菌次级代谢产物研究现状

1．4．3 药用植物雷公藤内生真菌次级代谢产物研究现状

1．5 课题的研究目的、意义

1．5．1 藏药唐冲那保抗乙酰胆碱酯酶生物活性研究目的和意义

1．5．2 三种药用植物内生真菌次级代谢产物的研究目的和意义

1．6 研究内容

1．6．1 藏药唐冲那保抗乙酰胆碱酯酶活性成分的研究

1．6．2 三种药用植物内生真菌次级代谢产物的生物活性成分研究

1．6．3 三株内生真菌菌株的分子生物学鉴定

第2章 藏药唐冲那保生物碱类成分的抗乙酰胆碱脂酶活性的研究

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．2．1 植物材料

2．2．2 实验仪器

2．2．3 试剂及材料

2．3 实验方法

2．3．1 唐冲那保生物碱提取物的制备

2．3．2 溶液的配制

2．3．3 唐冲那保中乙酰胆碱酯酶抑制剂的跟踪分离

2．3．4 化合物的抗乙酰胆碱酯酶活性测定

2．4 结果与讨论

2．4．1 化合物的分子结构式

2．4．2 化合物结构鉴定

2．4．3 化合物抗乙酰胆碱酯酶活性测定

2．4．4 讨论

第3章 一株半夏内生真菌次级代谢产物及生物活性的研究

3．1 引言

3．2 材料与仪器

3．2．1 检测用细胞株

3．2．2 菌株及培养基

3．2．3 实验仪器

3．2．4 试剂及材料

3．3 实验方法

3．3．1 半夏内生真菌BX-9次级代谢产物化学成分研究

3．3．2 BX-9菌丝体和发酵液次级代谢产物生物活性测定

3．4 结果与讨论

3．4．1 化合物结构式

3．4．2 化合物结构鉴定

3．4．3 化合物抗乙酰胆碱酯酶活性测定结果

3．4．4 抗肿瘤活性测定结果

3．4．5 讨论

第4章 一株狼毒内生真菌次级代谢产物及生物活性的研究

4．1 引言

4．2 材料与仪器

4．2．1 检测用细胞株

4．1．2 菌株及培养基

4．2．2 实验仪器

4．2．3 试剂及材料

4．3 实验方法

4．3．1 狼毒内生真菌LD-3次级代谢产物化学成分研究

4．3．2 LD-3菌丝体次级代谢产物生物活性测定

4．4 结果与讨论

4．4．1 化合物的分子结构式

4．4．2 化合物结构鉴定

4．4．3 抗乙酰胆碱酯酶活性测定结果

4．4．4 抗肿瘤活性测定结果

4．4．5 讨论

第5章 一株雷公藤内生真菌次级代谢产物及生物活性的研究

5．1 引言

5．2 材料与仪器

5．2．1 检测用细胞株

5．2．2 菌株及培养基

5．2．3 实验动物

5．2．4 实验仪器

5．2．5 试剂及材料

5．3 实验方法

5．3．1 雷公藤内生真菌LGT-3次级代谢产物化学成分研究

5．3．2 LGT-3次级代谢产物生物活性测定

5．4 结果与讨论

5．4．1 化合物结构式

5．4．2 化合物结构鉴定

5．4．3 抗乙酰胆碱酯酶活性测定结果

5．4．3 抗单胺氧化酶活性测定结果

5．4．4 化合物抗肿瘤活性的测定结果

5．4．5 讨论

第6章 三株药用植物内生真菌菌株的分子生物学鉴定

6．1 前言

6．2 材实和仪器

6．2．1 待测菌株

6．2．2 培养基及缓冲液配制

6．2．3 实验仪器

6．2．4 实验试剂

6．3 实验方法

6．3．1 菌丝体DNA的提取

6．3．2 DNA纯度的检测

6．3．3 ITS-PCR扩增

6．3．4 扩增产物的纯化及序列的测定

6．3．5 扩增产物序列的分析

6．4 结果与分析

6．5 讨论

结论

参考文献

致谢

附录A (攻读硕士学位期间所发表的论文及成果)