RNA干扰抑制ERCC1对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响(体外实验)

摘要

目的:探讨利用RNA干扰技术沉默ERCC1基因表达对非小细胞肺癌耐药细胞株顺铂化疗敏感性的影响。
　　 方法:常规培养肺癌A549/DDP细胞;设计并合成靶向人的ERCC1基因的ERCC1-siRNA1、ERCC1-siRNA2、ERCC1-siRNA3、NCERCC1-siRNA,构建携带ERCC1-shRNA的重组质粒表达载体,采用脂质体Lipofectamine2000转染入人肺癌细胞株A549/DDP,荧光镜下观察并测定转染效率;应用实时定量RT-PCR检测转染前后ERCCImRNA的表达情况;应用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测干扰ERCC1后A549/DDP细胞对顺铂敏感性的变化。
　　 结果:1.分别于转染24h、36h、48h后收获细胞,应用实时荧光定量RT-PCR检测ERCC1-siRNA干扰对各组细胞ERCC1mRNA表达水平的影响。转染24h后,ERCC1-siRNA1组相对表达量为(0.580±0.015),ERCC1-siRNA2组为(0.732±0.365),ERCC1-siRNA3组为(0.441±0.563),与空白对照组、NCERCC1-siRNA组相比,ERCC1mRNA表达均下调(P＜0.05),而ERCC1-siRNA3组有显著差异(P＜0.01);转染36h后,ERCC1-siRNA1组相对表达量为(0.576±0.468),ERCC1-siRNA2组为(0.652±0.273),ERCC1-siRNA3组为(0.212±0.236),与空白对照组、NCERCC1-siRNA组相比,ERCC1mRNA表达下调(P＜0.05),ERCC1-siRNA3组有显著差异(P＜0.01);转染48h后,ERCC1-siRNA1组相对表达量为(0.556±0.134),ERCC1-siRNA2组为(0.618±0.025),ERCC1-siRNA3组为(0.206±0.089),与空白对照组、NCERCC1-siRNA组相比,ERCC1mRNA表达下调(P＜0.05),而ERCC1-siRNA3组有显著差异(P＜0.01);各组内比较,无明显差异(P＞0.05)。2.MTT实验结果表明,转染后肺癌A549/DDP细胞对顺铂IC50值降低;其中空白对照组对顺铂的IC50值为19.72±2.98ug/ml,转染ERCC1-siRNA1、ERCC1-siRNA2、ERCC1-siRNA3后A549/DDP细胞对顺铂的IC50值分别为4.59±1.56ug/ml、5.61±2.11ug/ml、0.88±3.01ug/ml;与空白对照组相比,均有差异(P＜0.05);而转染阴性对照组NCERCC1-siRNA的A549/DDP细胞对DDP的IC50为18.26±2.74ug/mL,与空白对照组相比无显著差异(P＞0.05)。
　　 结论:利用RNA干扰技术能够筛选出高效的特异阻断ERCC1基因表达的siRNA;ERCC1基因表达下调能够增加肺癌A549/DDP细胞对顺铂的敏感性,部分逆转耐药。