N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明盐酸盐制备工艺及抗阿尔兹海默症药效学研究

摘要

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)是一种渐进性的神经功能退化性失调的老年性疾病，主要表现为记忆力减弱及识别能力障碍等。目前治疗AD病的几类药物中，乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物对阿尔茨海默症的疗效明确，是治疗该症最主要的一线药物。本课题组在前期研究发现了一个强效的乙酰胆碱酯酶抑制剂N-(4-硝基苯）氧乙基异锥丝明，是由止泻木干燥种子中分离的异锥丝明经衍生化得到的。但是，由于其制备工艺复杂，需要多次反复柱层析。使得制备原料所需的周期长，影响后期的药效学和药理学的研究，因此，本文对N-(4-硝基苯）氧乙基异锥丝明盐酸盐的制备工艺进行了研究，并对其药代动力学和药效学进行了评价，研究结果如下：
　　1.N-(4-硝基苯）氧乙基异锥丝明盐酸盐的制备工艺
　　（1）止泻木干燥种子总生物碱的提取工艺优化
　　在单因素试验的基础上，对工艺参数进行四因素三水平响应面设计试验，以硫酸的消耗量为响应值进行响应面分析，优化止泻木中总生物碱的提取工艺参数。结果表明各因素对止泻木干燥种子中总生物碱提取得率的影响顺序依次为：提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比。最佳提取工艺为乙醇浓度85%、提取时间3h、液料比1:10g/mL、提取温度80℃，此条件下，硫酸的消耗量为2.86mL，计算得到得止泻木种子中总生物碱产率为23.8±0.12mg/g。
　　（2）N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明盐酸盐的制备工艺
　　对止泻木干燥种子总生物碱通过大孔树脂柱层析分离纯化，得到低纯度的异锥丝明的粗组分，以此为原料与2-溴乙基-（4-硝基苯）酚醚回流反应，反应产物经硅胶柱层析分离，得到纯度大于98%的N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明。经HCl酸化后，得到N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明盐酸盐。该制备工艺与前期课题组所用的工艺相比，具有操作简单，制备周期短的特点。
　　2.大鼠体内N-(4-硝基苯）氧乙基异锥丝明的检测方法学研究
　　本研究建立了高效液相色谱（HPLC）测定大鼠生物样品中N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明含量的方法。其色谱条件为：色谱柱：Phenomenex Gemini C18,（5μ,110A,150×4.6mm）；流动相：甲醇:水：三乙胺(70:30:3‰v/v/v)；检测波长：300nm；流速：1.0mL/min。考察了最低检测限、精密度、准确度和回收率等参数。结果表明：在上述条件下，生物样品中的N-(4-硝基苯）氧乙基异锥丝明峰形良好。最低检测限为0.08μg/mL。日内、日间精密度范围分别为0.69～1.05%和0.78～0.96％，均小于15%。回收率为87.95%～97.25%，相对标准偏差低于1.12%，由此可见，该方法灵敏度好、准确度高、线性好，符合定量分析方法的要求，能够满足N-(4-硝基苯）氧乙基异锥丝明药代动力学和组织分布研究的需要。
　　3.N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明盐酸盐药代动力学特征和组织分布研究
　　大鼠经灌胃给药N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明盐酸盐后，将测得的血浆样品数据用DAS3.0进行处理。其药代动力学参数：Cmax：2.81±0.36μg/mL；Tmax：2.48±0.12h；T1/2：12.24±1.15h：AUC(0-t)：68.80±2.14μg/L.h；CL：0.71±0.21L/h/kg；Vd：12.42±1.26L/kg。结果显示，在大鼠体内的药代动力学过程符合二室开放模型，N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明盐酸盐在大鼠体内中具有消除缓慢和分布体积大等特点。
　　大鼠体内的各组织分布研究表明：给药9h后，肝，小肠，胃，大肠是大鼠N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明盐酸盐的主要分布组织。在脑组织中一定程度上检测到了N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明，表明N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明可以穿过血脑屏障。
　　4.N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明盐酸盐对东莨菪碱诱导学习记忆障碍大鼠的行为学研究
　　本部分实验通过腹腔注射东莨菪碱建立大鼠学习记忆障碍模型，通过Morris水迷宫实验评价N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明盐酸盐对学习记忆障碍大鼠的影响。
　　（1）定位航行实验
　　空白对照组的逃避潜伏期明显低于东莨菪碱组（模型组），具有极显著性差异（＃＃P﹤0.01）；石杉碱甲组和给药组（高、中剂量组）与东莨菪碱组相比，大鼠的逃避潜伏期明显缩短，均具有极显著性差异（**P﹤0.01）；低剂量组具有显著性差异（东莨菪碱组比较：*P﹤0.05）。结果表明，本研究测试药物N-(4-硝基苯）氧乙基异锥丝明盐酸盐对学习记忆障碍大鼠的学习记忆行为能力有明显的改善作用。
　　（2）空间探索实验
　　东莨菪碱组（模型组）的平均寻求安全平台和有效区域次数明显减少，具有极显著性差异（与空白对照组比较：＃＃P﹤0.01）。空白对照组、石杉碱甲组、给药组（低、中及高剂量组）的平均寻求平台次数均高于东莨菪碱组，均具有显著性差异（*P﹤0.05），其中高、中剂量组具有极显著性差异（与东莨菪碱组比较：**P﹤0.01）。说明经过本研究药物N-(4-硝基苯）氧乙基异锥丝明盐酸盐治疗之后，对习记忆障碍大鼠的记忆行为有显著的改善。结果表明，通过药物治疗，对学习记忆障碍大鼠的学习记忆行为能力有明显的改善作用。

目录

声明

第一章 绪论

1.1阿尔兹海默病概况

1.2阿尔兹海默病的发病机理

1.3治疗AD常用药物的研究进展

1.4常用痴呆动物模型的研究进展

1.5止泻木简介

1.6本课题的研究目的和意义

第二章 止泻木种子中总生物碱提取工艺以及N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明盐酸盐制备工艺研究

2.1引言

2.2材料

2.3止泻木总生物碱提取工艺研究

2.4 N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明盐酸盐制备工艺

2.5结果与分析

2.6本章小结

第三章HPLC测定生物样品中N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明的方法学研究

3.1引言

3.2仪器与材料

3.3溶液的配制

3.4生物样品的制备

3.5色谱条件

3.6实验结果

3.7本章小结

第四章 N-(4-硝基苯)氧乙基异锥丝明盐酸盐在Wistar大鼠体内的药代动力学和组织分布研究

4.1引言

4.2仪器与材料

4.3实验方法

4.4结果分析

4.5本章小结

第五章 N-(4-硝基苯）氧乙基异锥丝明盐酸盐对东莨菪碱诱导记忆障碍大鼠的行为学研究

5.1引言

5.2仪器与材料

5.3实验方法

5.4实验结果

5.5本章小结

结论

参考文献

致谢

附录A在学期间发表的论文及申请的专利

附录B（谱图）