人羊膜间充质细胞诱导成骨修复兔牙槽突裂的实验研究

摘要

目的：通过对人羊膜间充质细胞(hAMCs)体外诱导分化为成骨细胞，经明胶海绵搭载移植修复兔牙槽突裂，为牙槽突裂组织工程修复寻找理想的种子细胞来源。
　　 方法：采用手术方式在兔上颌骨制造一个1.0 cm×0.5cm楔状缺损，建立兔双侧牙槽突裂模型。采用机械法和酶分离法从人羊膜组织中分离出hAMCs，并进行体外培养，第三代细胞用流式细胞仪(FCM)分别检测表面分子CD44、CD29、CD45、CD34、CD166和CD71的表达情况，并采用免疫细胞化学方法检测波形蛋白进行细胞表型鉴定。对鉴定为hAMCs的第三代细胞加入DEX、VitC和β-GP进行定向诱导，使其向成骨细胞分化，21天后用茜素红S检测钙盐沉积判定其是否向成骨细胞分化。将认定分化成成骨细胞者应用到动物实验中。根据移植物的不同将建立的牙槽突裂兔随机分为A组(hAMCs与明胶海绵复合体；n=12)、B组(经诱导后hAMCs与明胶海绵复合体；n=12)、C组(单纯明胶海绵移植；n=12)，D组(空白对照；n=4)。于移植后2w、4w、6w、8w、12w处死各实验组2只实验动物，D组实验结束时一并处死。对移植区牙槽骨的厚度进行测量，常规HE染色及免疫组化染色以观察移植区新骨形成及细胞存活情况。
　　 结果：①第三代的hAMCs呈长梭形，漩涡样生长，表达CD29、CD166、CD44、CD73、波形蛋白，不表达CD34、CD45，并能很好的粘附生长于胶原一明胶海绵上；②经地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠，诱导21天后可检测出茜素红染色阳性的钙结节；③经手术移植后2w、4w、6w、8w、12w处死各实验组2只兔，12w大体标本示：A、B两组牙槽突缺损处大量骨质沉积，缺损处得以修复，C组：骨面粗糙，缺损处有骨质充填，缺损变小，变浅；D组：缺损变小，内侧见薄层骨质充填，中切牙牙根暴露或仅有少许骨质包绕。12w后在移植区牙槽骨厚度比较，A与B组，P>0.05；A与C、D组比较，P<0.05，B与C、D组比较P<0.05，C与D比较P<0.05。④ HE染色：A，B两组在术后2W可见成骨细胞聚集区，但B组出现钙盐沉积较A组早，C组各个时期均未发现成骨细胞聚集区。⑤移植后12周A组与B组经免疫组化检测到抗人细胞核抗体的细胞存在，C、D组未检测到抗人细胞核抗体的细胞。
　　 结论：1、hAMCs表达典型的间充质干细胞的表面标志，可以在体外诱导成骨；
　　 2、hAMCs及诱导成骨后都可以很好的生长于胶原-明胶海绵；
　　 3、hAMCs及成骨诱导后的hAMCs均可在体内成活；
　　 4、hAMCs可在体内分化骨，但其体内分化的机制、植入细胞存活率、分化率、转归还有待进一步研究；
　　 5、hAMCs有望成为组织工程修复牙槽突裂地种子细胞。