初级纤毛在肺微血管内皮细胞抗缺氧损伤中的作用及机制研究

摘要

缺氧是导致多种急、慢性疾病的重要原因。在缺氧状态下，机体处于氧化胁迫状态，由活性氧（ROS）和其它自由基引起的脂质过氧化、蛋白质氧化、糖化氧化和DNA氧化损伤等可导致细胞凋亡和坏死，并进而引起组织结构与功能的退变。高原缺氧更是可以引起体内多系统暂时或永久性改变，甚至诱发高原脑水肿和高原肺水肿等致死性疾病。机体存在一套天然的抗氧化防御系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPH-PX）、维生素E和抗坏血酸等，它们可以消灭或中和自由基以抵御氧化损伤。本课题组以前研究发现，初级纤毛在细胞抗氧化应激中起到重要作用，干扰掉初级纤毛后细胞的抗缺氧能力几乎丧失，相关抗氧化信号通路也被中断，但具体机制尚不清楚。本论文将就此展开进一步研究。 本实验将生长至融合状态的肺微血管内皮细胞（PMVEC）进行如下处理：（1）将PMVEC细胞置于O2浓度为2%的密闭缺氧装置中培养0、6、12、18和24h；（2）先用siRNA法抑制PMVEC细胞的初级纤毛发生，然后将其置于密闭缺氧装置中培养相同时间。在倒置显微镜下观察上述经过缺氧处理的细胞形态，用免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜观察初级纤毛发生率以及长度变化，研究抗氧化信号途径相关因子的核转位及在初级纤毛的定位情况，检测氧化抗氧化指标谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）的酶活力及氧化指标丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量，用Western blot和RT-PCR法分析抗氧化信号途径相关因子的蛋白及其基因的表达变化情况。 实验结果：缺氧处理导致PMVEC初级纤毛的发生率上升，长度增加，抗氧化酶活力则呈先显著升高然后逐渐降低的变化趋势，氧化产物含量先显著增加后又降低；用RNAi法抑制IFT88表达后，免疫荧光染色法观察到转染对照组（Negative control,NC组）的初级纤毛、抗氧化酶活力和氧化产物含量变化趋势与未经转染处理的正常对照组基本一致，但siRNA组抗氧化酶活性没有明显升高，氧化产物含量始终显著高于NC组；NC组抗缺氧信号通路中Nrf2、HIF-1α和HIF-2α蛋白表达量呈现先升高后下降的变化趋势，并发生明显的核转位；siRNA组上述蛋白的表达水平几乎无变化，无核转位发生。NC组Nrf2、HIF-1α和HIF-2α的基因表达量呈现先显著升高后下降的趋势，RNAi几乎无变化。 上述实验结果表明，失去初级纤毛的PMVEC细胞较正常细胞的抗氧化酶活性降低，抗氧化应激相关信号因子蛋白和基因的表达水平下降，核转位消失，表明该细胞失去初级纤毛后，细胞无法启动其内在的抗缺氧损伤和抗氧化应激防御系统。此结果初步证明初级纤毛是细胞的氧感受器，同时也为抗缺氧药物研发提供了新思路。

目录

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英文缩写词表

第1章绪论

1.1缺氧损伤研究现状

1.1.1缺氧引起的症状及其危害

1.1.2抗缺氧损伤的生理机制

1.1.3抗缺氧损伤治疗的研究现状

1.2初级纤毛

1.2.1初级纤毛简介

1.2.2与初级纤毛相关的信号通路

1.3缺氧与初级纤毛

1.3.1缺氧与初级纤毛长度及发生率的关系

1.3.2抗缺氧途径与初级纤毛

1.4课题研究内容及意义

第2章 缺氧对PMVEC细胞初级纤毛及氧化/抗氧化的影响

2.1实验材料

2.1.1实验细胞

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1 PMVEC细胞培养与形态学观察

2.2.2 PMVEC细胞的物理性缺氧处理

2.2.3免疫荧光染色观察初级纤毛

2.2.4细胞全蛋白的提取

2.2.5氧化产物MDA、ROS的检测

2.2.6抗氧化酶GSH-PX、SOD酶活力值检测

2.2.7统计学分析

2.3结果

2.3.1缺氧对PMVEC细胞形态的影响

2.3.2缺氧后初级纤毛发生率的变化

2.3.3缺氧后初级纤毛长度的变化

2.3.4缺氧对氧化产物含量的影响

2.3.5缺氧对抗氧化酶活力的影响

2.4讨论

第3章 siRNA干扰法建立去除初级纤毛PMVEC细胞模型

3.1实验材料

3.1.1实验细胞

3.1.2主要试剂

3.1.3主要仪器设备

3.2实验方法

3.2.1 PMVEC细胞培养

3.2.2 siRNA法干扰初级纤毛的发生

3.2.3 RT-PCR基因检测

3.2.4Western Blot蛋白检测

3.2.5统计学分析

3.3结果与分析

3.3.1质粒转染效率分析

3.3.2干扰前后初级纤毛的变化

3.3.3干扰前后IFT-88的基因和蛋白表达情况

3.4讨论

第4章 初级纤毛对在PMVEC抗缺氧损伤中的作用及其机制

4.1实验材料

4.1.1实验细胞

4.1.2主要试剂

4.1.3主要仪器设备

4.2实验方法

4.2.1 siRNA法干扰初级纤毛的发生

4.2.2 PMVEC细胞的物理性缺氧处理

4.2.3抗氧化酶GSH-PX、SOD酶活力值检测

4.2.4氧化产物MDA、ROS含量检测

4.2.5免疫荧光染色

4.2.6Western Blot蛋白检测

4.2.7 RT-PCR基因检测

4.2.8统计学分析

4.3结果与分析

4.3.1去除初级纤毛前后胞内氧化产物的变化

4.3.2去除初级纤毛前后胞内抗氧化酶活力的变化

4.3.3去除初级纤毛前后Nrf2、HIF-1α和HIF-2α基因表达变化情况

4.3.4去除初级纤毛前后Nrf2、HIF-1α和HIF-2α蛋白表达量的变化

4.3.5去除初级纤毛前后Nrf2、HIF-1α和HIF-2α发生核转位情况

4.4讨论

结论

参考文献

致谢

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