基于千里光全长cDNA文库的表达序列标签(ESTs)与HsP90-3生物信息学分析

摘要

目的：构建千里光叶片组织全长cDNA文库，并对该文库进行随机克隆测序及分析，部分基因进行生物信息学研究，以期了解千里光的功能基因组学信息，并为EST-SSRs(simple sequence repeats，简单序列重复)引物的开发及ESTs(expressed sequence tags，表达序列标签)图谱构建提供基础资料。
　　 方法：采用Trizol法提取千里光新鲜叶片组织中的总RNA，通过SMART(SwitchingMechanism At5’end of RNA Transcript)技术构建全长cDNA文库；分析文库滴度、库容、重组率、全长率及冗余率，随机选择600个单克隆进行全长cDNA测序；利用NCBI的Blast进行核苷酸序列比对，SUmDNAMAN、Expasy Protparam、PROSITE、ProScale、CPHmodels-3.0、Swiss-model等软件对目的蛋白进行生物信息学分析。
　　 结果：
　　 (1)经检测原始文库的库容为4.3×106cfu，文库滴度为1.3×106cfu/mL，插入片段大小平均1.5 kb，文库重组率96.35％，冗余率10.88％，全长率为64.00％，满足全长cDNA文库质量要求。
　　 (2)测序得到244条高质量ESTs，含有244条独立基因(unigenes)。Blast比对后得出133条序列没有注解，80条序列与GenBank上公布的序列有较高同源性。
　　 测序得到的524条高质量cDNA序列中，含有467条unigenes，其中5条序列与千里光次生代谢产物的合成、运输与代谢有关。
　　 (3)通过单克隆全长测序得到了千里光Hsp90-3(Heat shock proteins90-3，热激蛋白90-3)的全长基因，采用生物学软件对序列进行生物信息学分析和功能预测，结果表明，该基因编码699个氨基酸的多肽，与拟南芥Hsp90-3(登录号：NP_200412.1)的同源性最高，为93.71％；预测蛋白质的分子量为79.78 kDa，理论等电点为5.08。信号序列分析结果发现，该蛋白主要定位于细胞的细胞核、过氧化物酶体、叶绿体类囊体膜及叶绿体基质中。
　　 结论：(1)SMART技术能有效构建高质量全长cDNA文库，该文库可用于千里光功能基因组鉴定、新基因筛选及次生代谢产物生物合成的表达调控研究。
　　 (2)通过对得到的千里光的功能基因进行分析及预测，结果表明所获得的千里光的功能基因多表现与千里光生理特征或合成相关的各种代谢酶以及抗逆性等方面。
　　 (3)千里光Hsp90-3结构与功能分析发现，该蛋白有3个结构域及一个连接区，推测该蛋白在真核细胞的信号转导、转录调控及胁迫表达等过程中发挥重要功能。