人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎治疗效应及免疫调节作用

摘要

目的:多发性硬化(MS)是一种以中枢神经系统脱髓鞘病变为主的自身免疫病。目前尚无根治方法。人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)和人羊膜上皮细胞(hAECs)具有免疫调节作用,为治疗MS提供了可能。本研究以大鼠实验性自身免疫性脑脊髓(EAE)作为MS的模型,观察hAMSCs和hAECs的治疗效应和免疫调节作用。
　　 方法:①采用胰酶-胶原酶两步消化法分离培养hAMSCs、hAECs细胞,用流式细胞术(FCM)和免疫组化进行鉴定。②采用豚鼠脊髓匀浆+完全弗氏佐剂(CFA)+百日咳毒素(PTx)复制EAE大鼠模型。成模动物随机分为模型组(n=12)、培养基组(n＝6)、hAMSCs治疗组(n=12)、hAECs治疗组(n=12)和泼尼松治疗组(n＝12)。另设正常组(n=6)作为平行对照。细胞治疗组经双侧侧脑室注射hAMSCs或hAECs悬液10μl/只（含5×105个细胞）,培养基组同样的途径注射等体积无血清的L-DMEM培养基,药物治疗组腹腔注射泼尼松25mg/(kg.d)连续一周。③动态观察动物体重变化,采用kono评分观察行为学改变。④HE染色观察大鼠脑和脊髓组织病理改变。⑤细胞移植后3周和5周,免疫荧光染色示踪供体细胞在脑和脊髓组织内的分布。⑥细胞移植后3周和5周,流式细胞术(FCM)检测大鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg、Tc1和Tc2 T淋巴细胞亚群变化。⑦流式微球芯片捕获技术(CBA)检测血浆细胞因子IFN-γ、 TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10的含量。
　　 结果:①第3代hAMSCs表达CD44、CD73、CD90、CD105及波形蛋白阳性,不表达CD14、CD19、CD34、CD45、CD80、CD86和HLA-DR;第三代hAECs表达CD29、CD44、CD73及CK19阳性,不表达CD34、CD45、CD71、CD80、CD86和HLA-DR。②hAMSCs和hAECs治疗组分别于移植后第5天和第3天开始至观察期结束,kono评分均明显低于模型组和培养基组(P＜0.05; P＜0.01);第20天至第35天,hAECs组kono评分明显低于hAMSCs组(P＜0.05;P＜0.01);第14天至第35天,hAECs组kono评分明显低于泼尼松组(P＜0.05; P＜0.01)。③与正常组大鼠比较,各组大鼠体重不同程度下降,但hAMSCs和hAECs治疗组从移植后9天起,动物体重止降启稳,至第5周渐增至移植时体重水平,且明显高于模型组、培养基组和泼尼松组（均P＜0.05）。④病理检查可见hAMSCs和hAECs治疗组脑和脊髓炎性细胞浸润明显减轻。⑤免疫荧光染色结果显示,hAMSCs组和hAECs组移植后3周和5周,脑和脊髓组织中均有较多人细胞核抗原阳性即hAMSCs和hAECs存活。⑥FCM分析结果显示,与模型组比较, hAMSCs治疗组、hAECs治疗组和泼尼松组Th2、Tc1（CD4-CD8+IFN-γ+）、Tc2(CD4-CD8+IL-4+)和Treg细胞百分率均明显升高（P＜0.05; P＜0.01）,而Th17显著下降(均P＜0.01),Th1/Th2和Th17/Treg比值均降低(P＜0.05;P＜0.01);hAMSCs组和hAECs组比较,后者Th1细胞下降和Treg细胞升高更为显著(P＜0.05); hAMSCs组和hAECs组与泼尼松组比较, Th17细胞下降更明显(P＜0.01; P＜0.05)。⑦CBA法检测结果显示,与模型组比较,hAMSCs和hAECs治疗组第3周和第5周IL-2和IFN-γ含量均明显降低(P＜0.05;P＜0.01),IL-4和IL-10均显著升高（P＜0.05;P＜0.01）;与泼尼松组比较,第3周和第5周hAMSCs和hAECs组IL-2的含量均明显降低（均P＜0.05）,第5周IL-10含量明显升高(P＜0.05),第5周hAECs组TNF-α明显减少;hAECs组第5周TNF-α的含量明显低于hAMSCs组(P＜0.05)。
　　 结论:hAMSCs和hAECs移植能明显改善EAE大鼠神经功能,其机制可能主要与调节淋巴细胞亚群,尤其与上调FoxP3+Treg和下调Th17有关,提示hAMSCs和hAECs作为临床MS的免疫调节治疗具有潜在应用价值。

目录

声明

英文缩略词对照表

摘要

前言

1 材料与方法

1．1 主要实验材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 hAMSCs和hAECs形态及表型特征

2．2 行为学和体重变化

2．3 组织学变化

2．4 hAMSCs与hAECs移植后的分布

2．5 淋巴细胞亚群变化

2．6 血浆细胞因子含量的变化

3 讨论

4 结论

参考文献

综述 干细胞移植治疗多发性硬化的研究进展

致谢

作者简介