单重PCR诊断手部非结核分枝杆菌感染初探

摘要

目的:通过特异性的单重PCR检测手部非结核分枝杆菌，寻找快速、准确的诊断方法。
　　 方法:取临床病例手部NTM感染的病灶组织20例，一份行病理检测，一份提取病灶组织中非结核分枝杆菌DNA。选取感染手部常见的非结核分枝杆菌常见菌种，通过Genbank数据库和文献找到非结核分枝杆菌亚种的特异性基因片段5种，分别是hsp65、ITS2、IS1245、IS2404、P6123，根据靶序列设计引物。提取临床标本及标准菌株的总DNA进行靶序列的PCR，扩增条件如下:退火温度55℃、退火温度梯度52～63℃及63～70℃，引物浓度及循环次数分组，并计算检测率，采取卡方检验，找到本实验的最适宜条件。在最适宜PCR反应体系下进行临床标本与标准菌株DNA扩增，通过凝胶电泳的目的条带比对，达到鉴定非结核分枝杆菌种及亚种，并进行靶序列测序。
　　 结果:1.临床标本组织单重PCR扩增出的目的条带，与标准菌株海分枝杆菌、胞内分枝杆菌扩增出的目的条带均符合。2.20例临床标本组织检测结果:海分枝杆菌11例，胞内1例，鸟分枝杆菌1例，2例标本出现双重感染，1例是海分枝杆菌和胞内分枝杆菌混合感染，1例是鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌混合感染，5例未检测出。3.退火温度63℃、反应体积20ul、引物浓度2.5umol/L或5umol/L、循环30次或35次是本实验最佳条件。4.DNA测序结果，标准菌株海分枝杆菌及胞内分枝杆菌与Genebank数据库中海分枝杆菌与胞内分枝杆菌的同缘性达99％，偶然分枝杆菌达100％，临床标本PCR产物测序序列与6enbank数据库比对，与海分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌同缘性达98％以上，临床标本PCR产物测序结果与标准菌株测序结果比对，临床标本测序序列均符合标准菌株序列。
　　 结论:1.应用特异性的单重PCR检测手部非结核分枝杆菌感染，可早期、准确、可靠地检测出致病菌，可以鉴定非结核分枝杆菌到种及亚种。2.PCR条件优化后，推断本检测方法更加经济、快速。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

1 材料与方法

1．1 主要实验材料

1．2 主要实验仪器

1．3 主要实验试剂

1．4 实验方法

2 结果

2．1 临床提取的细菌DNA进行单重PCR

2．2 标准菌株提取的DNA进行PCR与临床标本扩增出的相应的分枝杆菌比对结果

2．3 标准菌株单重PCR扩增的目的条带进行DNA双向测序结果与GenBanK数据库(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)比对结果

2．4 临床标本单重PCR扩增的目的条带进行DNA双向测序序列与GenBanK数据库比对结果

2．5 标准菌株单重PCR扩增的目的条带测序序列、临床标本测序序列、GenBanK数据库所选择的相应基因序列，三者经ClustalX1．81软件比对结果

2．6 本研究20例临床标本PCR结果

3 讨论

3．1 引物设计的特异性及合理性

3．2 细菌DNA提取的准确、可靠

3．3 实验方法

3．4 结果的分析

3．5 展望

4 结论

参考文献

综述

致谢

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