检测4种手部非结核分枝杆菌感染的多重PCR方法的建立

摘要

目的：建立一种特异、敏感、快速的检测海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的双重PCR和胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、龟分枝杆菌的三重PCR方法，为临床快速鉴定手部非结核分枝杆菌感染的早诊断、早治疗提供检测方法。
　　方法：在GeneBank数据库和文献中分别查找出海分枝杆菌、胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、龟分枝杆菌4种手部常见NTM的特异基因序列，根据上述四种细菌的特异基因序列用 NCBI/Primer-BLAST软件系统设计各自引物序列，并用MFEPrimer-2.0软件筛选出特异的、相互间无互补或互补配对较少的引物分别构建海、溃疡分枝杆菌的双重PCR和胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、龟分枝杆菌3种NTM的三重PCR。将从菌种库购买的海分枝杆菌、胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、龟分枝杆菌4种标准菌株进行增殖培养，培养后将菌落移至无菌的营养肉汤中培养1～2天进行标准菌DNA的提取。用海、溃疡、胞内、龟分枝杆菌的DNA与相应细菌的引物进行单重 PCR扩增验证引物的特异性，再用海分枝杆菌的引物、溃疡分枝杆菌的引物分别和海、溃疡分枝杆菌的DNA扩增验证双重PCR的特异性，同理，用胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、龟分枝杆菌的特异性引物和胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、龟分枝杆菌的DNA扩增验证三重PCR的特异性。同时，根据双重PCR、三重PCR各自的引物的退火温度，摸索最佳退火温度，优化实验条件。将构建的两个多重PCR用于14例考虑手部NTM感染标本的检测。
　　结果：
　　1.用成功构建的两个多重PCR检测14例临床手部考虑NTM感染标本，检出率为93％；
　　2.海、溃疡分枝杆菌的双重PCR、胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、龟分枝杆菌的三重 PCR最佳退火温度分别是57.5℃、58.6℃；
　　3.两个多重 PCR检测临床手部NTM感染标本的时间大约是6小时，较传统实验室鉴定NTM时间短。
　　结论：本研究构建的两个多重PCR可鉴定引起手部感染的海分枝杆菌、胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、龟分枝杆菌的常见NTM，可早期、快速、可靠的检测出临床标本中的四种NTM。

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前言

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

1.2 主要实验仪器

1.3 主要试剂

1.4 实验方法

2 结果

2.1 设计的引物

2.2 标准菌单一PCR扩增及引物特异性检测

2.3两个多重PCR的特异性、准确性检测

2.4多重PCR的退火温度优化

2.5 多重PCR检测临床标本

3 讨论

3.1 多重PCR引物的设计

3.2 多重PCR的退火温度优化

3.3 非结核分枝杆菌标准菌的培养及DNA提取

3.4多重PCR检测临床标本时间

4 结论

参考文献

综述:分子生物技术在手部非结核分枝杆菌感染快速诊断的研究进展

致谢

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