体外调节GJIC对兔成骨细胞成脂分化的影响

摘要

目的:通过利用缝隙连接激动剂或缝隙连接阻滞剂调节成骨细胞间缝隙连接通讯(gapjunction intracellular communication，GJIC)，来研究GJIC对成骨细胞成脂分化的影响，为骨量减少性疾病如骨质疏松症的治疗提供新思路。
　　 方法:①提取出生一周内的新西兰大白兔乳兔颅骨，采用酶消化—组织块联合培养法提取成骨细胞并传代培养至第三代，每2～3天换液，每天倒置显微镜下观察细胞形态变化。②取铺满培养板的第三代成骨细胞，采用钙化结节染色法（茜素红染色法）进行成骨细胞的鉴定。③取第三代成骨细胞，常规消化后制备超薄切片，采用H-7500型透射电镜观察成骨细胞间缝隙连接超微结构。④取第三代成骨细胞在成脂诱导培养液中培养并诱导成脂分化，将成骨细胞分为三组:增强组加入终浓度为1μmol/L的缝隙连接激动剂前列腺素E2(PGE2);抑制组加入终浓度为50μmol/L的缝隙连接阻滞剂18α-甘草次酸(18α-GA);设置空白对照组。倒置显微镜下每天观察细胞形态变化。⑤噻唑蓝(MTT)比色法测定1μmol/L的PGE2和50μmol/L的18α-GA对成骨细胞的增殖有无毒性作用。⑥三组细胞成脂诱导两周后，分别采用油红O脂肪染色法鉴定各组细胞中脂肪组织的生成。⑦三组细胞成脂诱导两周后，分别采用逆转录PCR(RT-PCR)技术检测各组细胞中脂肪特异性标记物—过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的mRNA表达水平。⑧三组细胞成脂诱导两周后，分别采用蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测各组细胞中Cx43蛋白表达水平。⑨将Cx43蛋白表达水平与PPARγmRNA表达水平进行线性相关分析。
　　 结果:①倒置显微镜下观察，第3天左右观察到成骨细胞从碎骨片周围游出，原代成骨细胞贴壁生长，呈短梭形、三角形或多角形等不规则形态。第6天左右清除碎骨片，第9～12天成骨细胞基本铺满培养瓶瓶底，即可进行传代。传代培养后，成骨细胞呈长梭形、鳞片形等形态，呈集落生长趋势。②取第三代成骨细胞进行茜素红染色，结果显示成骨细胞聚集处有大量被染成橘红色的钙化结节出现，证明提取的细胞为成骨细胞。③透射电镜观察成骨细胞间缝隙连接，可以观察到成骨细胞缝隙连接结构:每个缝隙连接由6个亚单位组成，位于相邻细胞的细胞间隙和细胞质之间，以利于细胞间的信号转导。④MTT比色法结果显示，实验组细胞经过1μmol/L的PGE2和50μmol/L的18α-GA处理24h后测490nm下吸光度（A值）显示增强组、抑制组、对照组三组A值分别为0.221±0.007，0.228±0.011，0.219±0.012，三组之间两两相比较P值均大于0.05，差异无统计学意义，证明1μmol/L的PGE2和50μmol/L的18α-GA对成骨细胞增殖均无毒性作用。⑤油红O染色显示，三组细胞成脂诱导两周后，细胞形态由原来的长梭形、鳞片形逐渐变为椭圆形，胞质中均有被红染的脂滴出现，证实三组细胞均向脂肪细胞分化。⑥RT-PCR结果显示，三组细胞成脂诱导两周后，增强组、抑制组、对照组三组PPARγmRNA相对表达量分别为0.078±0.022，1.106±0.085，0.425±0.041，增强组PPARγmRNA相对表达量分别与对照组和抑制组比较均明显降低(P＜0.01)，差异具有统计学意义，抑制组PPARγmRNA与对照组比较表达明显增高，(P＜0.01)，差异具有统计学意义。⑦Western-blot结果显示，三组细胞成脂诱导两周后，增强组、抑制组、对照组三组细胞Cx43蛋白相对表达量分别为0.926±0.067，0.055±0.015，0.191±0.049，增强组Cx43蛋白相对表达量分别与对照组和抑制组比较明显降低(P＜0.01)，差异具有统计学意义，抑制组Cx43蛋白与对照组比较表达明显增高(P＜0.01)，差异具有统计学意义。⑧线性相关分析显示，PPARγmRNA表达水平与Cx43蛋白表达水平呈负相关关系，r=-0.8356，差异具有统计学意义。
　　 结论:1.成骨细胞在成脂诱导环境下可以向脂肪细胞分化。2.在成骨细胞成脂分化中，增强成骨细胞间GJIC可以抑制成骨细胞成脂分化。3.在成骨细胞成脂分化中，抑制成骨细胞间GJIC可以促进成骨细胞成脂分化。

目录

声明

英文缩略词对照表

摘要

前言

1 材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂

1．3 溶液配制

1．4 主要仪器

2 方法

2．1 成骨细胞培养与传代培养

2．2 钙化结节染色法(茜素红法)对成骨细胞鉴定

2．3 透射电镜观察缝隙连接

2．4 噻唑蓝(MTT)比色法检测1μmol／L的PGE2和50μmol／L的18α-GA对成骨细胞增殖的毒性作用

2．5 成骨细胞诱导成脂分化与实验分组

2．6 油红O脂肪染色

2．7 PPARγmRNA半定量RT-PCR检测

2．8 Western-blot检测Cx43的表达

2．9 统计学分析

3 结果

3．1 成骨细胞提取与传代培养

3．2 成骨细胞钙结节染色(茜素红法)鉴定

3．3 透射电镜观察缝隙连接

3．4 MTT法检测药物1μmol／L PGE2和50μmol／L 18α-GA对成骨细胞增殖的毒性作用

3．5 成骨细胞成脂诱导

3．6 油红O脂肪染色

3．7 RT-PCR检测PPARγ的mRNA表达

3．8 Western-blot检测Cx43蛋白表达

4 讨论

1．成骨细胞的培养及鉴定

2．成骨细胞成脂分化

3．成骨细胞间GJIC及Cx43的调控

4．展望

5 结论

参考文献

综述 缝隙连接及connexin43在骨质疏松症中的研究进展

致谢

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