阻断吡娜地尔后处理大鼠心肌线粒体比较蛋白质组学的研究

摘要

目的：
　　 建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，观察5-羟葵酸阻断吡那地尔后处理对缺血再灌注损伤大鼠心脏功能的影响，利用蛋白组学研究技术观察心肌线粒体蛋白质表达的变化。
　　 方法：
　　 1.建立Langendorff大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型：将24只雄性SD大鼠随机分为正常组(Nor)、缺血再灌注损伤组(I/R)、吡那地尔后处理组(Pina)、5-羟葵酸阻断吡那地尔后处理组(5-HD+Pina)，每组8只：
　　 各组灌注方案：Nor组：持续灌注Kerbs-Henseleit缓冲液(K-H液)120 min，无缺血再灌注损伤。I/R组、Pina组、5-HD+Pina组，缺血前灌注K-H液平衡20min后，灌注4℃ ST.Thomas停跳液，使全心停跳缺血40 min，分别按以下方案续灌：I/R组：灌注K-H液60 min；Pina组：灌注K-H液前给予50μmol/L吡那地尔2 min，继之K-H液58min；5-HD+Pina组：依次灌注100μmol/L5-羟葵酸3min、50μmol/L吡那地尔2 min、K-H液55 min。记录各组平衡末和续灌末心率(HR)、左室发展压(LVDP)、左室舒张末压(LVDEP)、以及最大dp/dt等心功能的变化，并收集心室肌组织：
　　 2.差速离心及Nycodenz密度梯度离心提取、纯化大鼠心肌线粒体，并利用Western blot检测亚细胞器标识物以验证其纯度；
　　 3.Pina组与5-HD+Pina组心肌线粒体蛋白行双向凝胶电泳(2-DE)、染色、凝胶扫描后获得2-DE图像，以PD-Quest8.0软件分析各组差异表达蛋白点，并将各蛋白点挖取、酶解、质谱分析后获得差异蛋白的谱图；
　　 4.利用Western blot回复验证关键差异蛋白的表达趋势，以判断2-DE结果的可靠性。
　　 结果：
　　 1.利用Nycodenz密度梯度离心法进一步的提高了线粒体的纯度；
　　 2.平衡末各组间心功能无明显差异，灌注末Nor组及Pina组的心功能明显好于I/R组和5-HD+Pina组(P<0.05)，5-HD+Pina组与I/R组间心功能差异无统计学意义；
　　 3.两组蛋白进行2-DE，得到聚焦良好、相似性高的图像，在两组胶上平均检测出485±22个蛋白斑点；经分析后得到9个差异大于2倍以上的蛋白点，质谱分析成功获得差异蛋白谱图；
　　 4.通过分析，与Pina组比较在5-HD+Pina组表达下降的分别为：Spot5202、5205(NADH脱氢酶1α亚复合物10亚基，NDUFA10)，Spot6001(ATP合酶α亚基，ATPA)；表达升高的6个蛋白分别为：Spot2404(长链脂酰辅酶A脱氢酶，ACADL)，Spot5301(NADH脱氢酶1α亚复合物10亚基，NDUFA10)，Spot5402(NADH脱氢酶铁-硫蛋白2，NDUFS2)，Spot5503(乙醛脱氢酶2，ALDH2)，Spot6603(二氢硫辛酰胺转乙酰酶，丙酮酸脱氢酶复合体的组成部分，ODP2)，Spot6807(线粒体内膜蛋白，IMMT)。其中Spot5202、5205、5301经质谱鉴定均为NDUFA10，两个表达下调，一个表达升高。
　　 5.Western blo回复验证，在5-HD+Pina组中NDUFA10、NDUFS2及ALDH2较Pina组升高，ATPA较Pina组下降，其差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 结论：
　　 1.吡那地尔后处理能明显改善大鼠心脏功能，而5-羟葵酸可部分拮抗其保护作用；
　　 2.5-羟葵酸阻断吡那地尔后处理(线粒体敏感性心通道的开放被阻断)，可导致：
　　 ①心肌细胞发生缺血再灌注损伤引起ATPA表达下调，其原因可能是ATPA的转运尤其是跨膜过程受损；Pina可以维持线粒体内ATPA的稳定表达；
　　 ②ACADL、NDUFS2、ODP2、IMMT、ALDH2表达上调；可能是由于线粒体内H+增加、pH升高、ATP合成减少、醛类物质堆积等原因，促使这些蛋白质发生了代偿性的升高；
　　 ③心肌缺血再灌注损伤可影响NDUFA10的表达，期间NDUFA10可能发生了剪切或修饰；
　　 就以上蛋白质变化与mitoKATP之间的确切关系，尚待进一步深入研究。
　　 3.差速离心后再利用Nycodenz不连续密度梯度法离心，可获取较高纯度的心肌线粒体。