端粒酶hTERT基因反义核酸对TNF-α诱导的膀胱癌细胞（T24）凋亡的影响

摘要

目的端粒是真核细胞染色体末端特殊的DNA-蛋白质结构，人类端粒含有TAGGG重复序列，具有重要的生物学功能。端粒可稳定染色体，防止染色体末端融合，保护染色体结构基因。有关文献报道，85％-90％以上的肿瘤细胞表达端粒酶活性。因而抑制端粒酶活性具有潜在的肿瘤防治的前景。人类端粒酶主要由三部分组成：人类端粒酶RNA成分(hTR)，人类端粒酶相关蛋白(TEP1)，人类端粒酶反转录酶催化亚单位 (hTERT)。hTR的功能是为染色体端粒延伸起模板作用，人类端粒酶反转录酶催化亚单位 hTERT 是端粒酶活性表达的关键组分和限速因子。hTERT 基因mRNA在膀胱癌细胞中同时表现出高水平的表达，与端粒酶活性的表达一致。端粒酶RNA的反义核酸可以抑制端粒酶活性和肿瘤细胞的生长。本实验探讨hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(AS PS-ODN)对膀胱癌细胞T24端粒酶活性抑制作用及hTERT基因的反义寡核苷酸对细胞因子TNF-α诱导膀胱癌T24细胞凋亡的影响。 方法采用TRAP-银染法及TRAP-PCR-ELISA法检测膀胱癌细胞的端粒酶活性；采用RT-PCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT基因蛋白水平的变化；采用台盼蓝排斥试验观察hTERT AS PS-ODN与TNF-α共同作用对膀胱癌细胞T24生长活力的影响；倒置显微镜观察凋亡细胞的形态学变化；通过流式细胞仪测定凋亡细胞的百分率。结果 hTERT 基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(AS PS-ODN)作用于膀胱癌细胞T24 48h，其端粒酶活性下降，作用72h，其端粒酶活性受到抑制，与正义寡核苷酸组，空白对照组相比有显著性差异(P<0.05)；hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(AS PS-ODN)作用于膀胱癌细胞T24后，hTERT基因mRNA表达水平及蛋白表达水平均明显下降，与正义寡核苷酸组，空白对照组相比有显著性差异(P<0.05)：hTERT AS PS-ODN作用于膀胱癌细胞T24后加入TNF-α作用48小时，膀胱癌细胞T24的抑制率与对照组，S PS-ODN组，ASPS-ODN组，TNF-α组及S PS-ODN+TNF-α组相比有统计学差异(P<0.01)：hTERT AS PS-ODN作用于膀胱癌细胞T24后加入TNF-α作用48小时，细胞出现典型的凋亡形态变化；hTERT AS PS-ODN作用于膀胱癌细胞T24后加入TNF-α作48小时，凋亡细胞的百分率分别同对照组，S PS-ODN组，AS PS-ODN组，TNF-α组及S PS-ODN+TNF-α组相比有显著差异(P<0.05)。 结论通过hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-ODN)能特异性抑制hTERT基因的表达降低膀胱癌细胞T24端粒酶活性；hTERT基因反义核酸对TNF-α诱导膀胱癌细胞T24凋亡有增敏作用。

目录

声明

摘要

一.前言

二.研究对象，材料和方法

三.结果

四.讨论

五.结论

六.参考文献

七.攻读学位期间发表的学术论文

八.致谢

九.附录