RACE初步克隆胡麻β-酮脂酰-CoA合酶基因以及胡麻再生体系建立的研究

摘要

胡麻中超长链脂肪酸具有广泛的生理功能，它参与种子甘油酯、生物膜膜脂及鞘脂的合成，并为表皮蜡质的生物合成提供前体物质。超长链脂肪酸的合成由脂肪酰-CoA延长酶催化，其合成的第一步反应--缩合反应是限速步骤，由β-酮脂酰-CoA合酶(KCS)催化。目前，人们对脂肪酸延长酶基因的研究主要集中在KCS基因上。本实验首先利用简并引物获得胡麻β-酮脂酰-CoA合酶基因的DNA片段，并将预期得到的β-酮脂酰-CoA合酶基因命名为FKCS。再以此DNA片段为基础，利用3'RACE反应从胡麻叶片中克隆到FKCS的1082bp的cDNA片段，NCBI的ORF分析表明，它含有一个长度为822bp的开放阅读框和252bp完整的3’UTR。由于本实验中的5'RACE没有得到相应目的片段，仅通过3'RACE反应获得的cDNA推测出FKCS的273个氨基酸，位于FKCS的C端。序列同源性分析表明，FKCS所编码的蛋白质，其氨基酸序列与拟南芥中五种β-酮脂酰-CoA合酶有较高的同源性。通过系统进化树分析得知，FKCS与拟南芥KCS家族中亲缘关系最近的是KCS-1。而拟南芥的KCS-1主要与超长链脂肪酸的合成有关，因此推测胡麻中FKCS也与超长链脂肪酸的合成有关，FKCS可能是胡麻中一种新型的β-酮脂酰-CoA合酶。FKCS基因的克隆和测序为将来研究其在胡麻中的生物学功能奠定了基础。为了便于以后研究FKCS基因的功能，以胡麻的下胚轴为外植体，成功建立了胡麻的快繁再生体系：MS+300㎎/L水解酪蛋白+0.5㎎/L6-BA有利于愈伤组织及不定芽的生成；在促进不定芽生根方面，不添加任何植物激素的1/2MS培养基更有利于根的生长。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分前言

1、胡麻的开发研究价值

2、RACE技术在全长cDNA克隆中的应用

3、植物表皮蜡质研究进展

4、亚麻转基因技术研究进展

第二部分 材料与方法

1、材料与试剂

1.1植物材料、质粒、菌株、试剂

1.2主要仪器设备

1.3试剂配制

2实验方法

2.1扩增胡麻FAD基因片段

2.2扩增胡麻KCS基因片段

2.3 RACE技术克隆胡麻KCS(3-ketoacyl-CoA synthase)基因的cDNA

2.4胡麻再生体系建立的研究

2.5利用农杆菌介导法进行胡麻转基因的研究

第三部分结果与分析

1扩增胡麻FAD基因片段

1.1简并引物设计结果

1.2 PCR扩增结果

1.3重组子鉴定

1.4测序结果分析

2、胡麻KCS基因的扩增

2.1简并引物设计结果

2.2 PCR扩增结果

2.3 Cloning PCR(重组子鉴定)

2.4测序结果分析

3、RACE技术克隆胡麻KCS(3-ketoacyl-CoA synthase)基因的cDNA

3.1胡麻KCS基因3’端cDNA序列扩增

3.2胡麻KCS基因5’端cDNA序列扩增

4、胡麻再生体系建立的研究

5、利用农杆菌介导法进行胡麻转基因的研究

5.1抗生素对胡麻下胚轴再生的影响

5.2除菌及筛选培养

第四部分 讨论

1、RACE技术克隆全长cDNA

2、胡麻再生体系建立的研究

3、利用农杆菌介导法进行胡麻转基因的研究

小 结

参考文献

致 谢