PRDX2对人结直肠癌细胞株SW480侵袭转移的影响及相关机制研究

摘要

目的：通过Peroxiredoxin2（PRDX2）基因沉默和过表达慢病毒载体转染结直肠癌SW480细胞，获取PRDX2基因沉默和过表达稳定转染细胞株，探讨PRDX2在人结直肠癌细胞侵袭和转移等生物学特性中发挥的作用；利用TGF-β1诱导人结直肠癌SW480细胞发生上皮-间质转化（EMT），建立SW480细胞发生EMT的实验研究模型，研究PRDX2对人结直肠癌SW480细胞EMT和转移过程的影响并分析其可能分子作用机制。
　　方法：
　　1.将PRDX2基因沉默、过表达及其相对应的空载对照慢病毒载体分别转染SW480细胞，并建立稳定转染细胞株；采用免疫印迹(Western blot)和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法分别检测PRDX2基因沉默、过表达细胞中PRDX2蛋白和mRNA表达；用MTT、克隆形成试验检测各转染细胞增殖活性，Annexin V-PI染色检测细胞凋亡率，划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测细胞迁移、侵袭能力的变化，观察PRDX2在结直肠癌细胞生长及侵袭转移中的作用。
　　2.利用TGF-β1诱导人结直肠癌SW480细胞发生上皮-间质转化，倒置显微镜下观察细胞形态学变化，划痕实验检测细胞体外迁移能力；细胞免疫荧光、Western blot和qRT-PCR方法检测EMT标志蛋白E-cadherin、Vimentin的蛋白和mRNA表达。
　　3.一定浓度的TGF-β1分别诱导 PRDX2基因沉默（TGF-β1，5 ng/ml）和过表达（TGF-β1，10 ng/ml）稳定转染细胞株，在倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化；划痕实验和Transwell小室分别检测各细胞体外迁移和侵袭能力；细胞免疫荧光、Western blot和qRT-PCR法检测E-cadherin、Vimentin、Snail和Twist1蛋白和mRNA表达，观察PRDX2在调节结直肠癌细胞EMT进程中各相关因子表达。
　　4. PRDX2基因沉默组和过表达组细胞分别采用细胞免疫荧光检测 NF-κB胞内定位情况；Western blot检测NF-κB、IκBα、phospho-IκBαSer32、MMP-9、MMP-2蛋白表达；qRT-PCR检测MMP-9、MMP-2 mRNA表达，观察PRDX2在调节结直肠癌细胞侵袭转移过程中 NF-κB通路相关因子的表达变化；NF-κB通路特异性抑制剂 PDTC作用于PRDX2基因沉默细胞株，Western blot检测NF-κB、IκBα、phospho-IκBαSer32、E-cadherin、Snail、Twist1、MMP-9和MMP-2蛋白表达；qRT-PCR检测E-cadherin、Snail、Twist1、MMP-9和MMP-2 mRNA表达，探讨NF-κB通路阻断后对PRDX2所调节的结直肠癌细胞EMT和转移过程的影响。
　　结果：
　　1.与对照组相比，PRDX2沉默组细胞PRDX2蛋白和mRNA的表达显著降低（P<0.05）；PRDX2过表达组细胞PRDX2蛋白和mRNA的表达显著增加（P<0.05），成功建立PRDX2基因沉默和过表达稳定转染细胞株；PRDX2基因沉默可明显降低SW480细胞的增殖活性和克隆形成能力，促进细胞凋亡，同时细胞迁移、侵袭能力显著增加（P<0.05）；PRDX2基因过表达后细胞增殖活性和克隆形成能力明显增加，且细胞凋亡受到抑制，同时细胞迁移、侵袭能力较空载对照组明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　2.在TGF-β1诱导SW480细胞发生EMT过程中，细胞形态由上皮细胞形态转变为间质细胞形态，且细胞的迁移能力明显增加(P<0.05)；EMT标记蛋白E-cadherin蛋白及mRNA表达水平显著下降，同时Vimentin蛋白及mRNA表达明显增加（P<0.05）。3.在5 ng/ml TGF-β1诱导下，PRDX2基因沉默组细胞呈纺锤体样间质细胞表型，且细胞迁移和侵袭能力明显增强；E-cadherin蛋白及mRNA表达水平显著下降，Vimentin、Snail和Twist1蛋白及mRNA表达水平均明显增加（P<0.05）。在10 ng/ml TGF-β1诱导下，PRDX2基因过表达细胞仍大多呈上皮细胞形态，且细胞的迁移和侵袭能力受到抑制；E-cadherin蛋白及mRNA表达明显增加，Vimentin、Snail和Twist1蛋白及mRNA表达水平均显著降低（P<0.05）。
　　4. PRDX2基因沉默后NF-κB及phospho-IκBαSer32蛋白表达水平明显增加，且免疫荧光显示NF-κB大部分转移至细胞核内，但IκBα表达无明显变化，同时转移相关因子MMP-9、MMP-2蛋白及mRNA表达量显著增加（P<0.05）；而PRDX2基因过表达后NF-κB及phospho-IκBαSer32蛋白表达明显降低，且NF-κB主要表达于细胞质内，转移相关因子MMP-9、MMP-2蛋白及mRNA表达水平也显著降低（P<0.05）。NF-κB通路特异性抑制剂PDTC作用PRDX2基因沉默细胞株后，上皮标记蛋白E-cadherin表达明显上升，NF-κB、phospho-IκBαSer32、Snail、Twist1、MMP-9和MMP-2表达明显降低（P<0.05）。
　　结论：
　　1. PRDX2基因沉默抑制结直肠癌SW480细胞增殖，促进细胞凋亡，且可以明显增强细胞的迁移、侵袭能力；PRDX2基因过表达能够增加SW480细胞的增殖能力，抑制细胞凋亡，并可以显著抑制SW480细胞的迁移、侵袭能力。
　　2. PRDX2基因沉默促进结直肠癌SW480细胞发生EMT，从而促进细胞的侵袭和转移；PRDX2基因过表达抑制了上述过程。
　　3. PRDX2基因沉默可促使NF-κB入核并激活其转录活性，而PRDX2基因过表达则抑制其活性并使之滞留于细胞质中；PRDX2可通过阻止IκBα的磷酸化而抑制NF-κB的活性，从而参与调控结直肠癌细胞EMT的发生和转移过程。

目录

封面

声明

目录

中英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 PRDX2对结直肠癌SW480细胞侵袭转移的作用和影响

引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 PRDX2调控结直肠癌SW480细胞转移的分子作用机制

引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

综述: TGF-β介导的上皮-间质转化与恶性肿瘤转移关系的研究进展

致谢

作者简介