健脾化瘀方对缺氧诱导的人结肠癌SW480细胞株生物学影响及相关机制研究

摘要

目的：
　　探讨健脾化瘀方对缺氧诱导的人结肠癌细胞SW480生物学行为的影响，从肿瘤微环境角度进一步阐明健脾化瘀方抑制结肠癌生长转移的可能机制，为中药复方治疗肿瘤提供一些理论支持。
　　方法：
　　采用四甲基偶氮唑蓝法（MTT法）检测缺氧对照组和不同浓度的健脾化瘀方对缺氧诱导的结肠癌细胞SW480细胞株增殖能力的影响;采用基质-细胞粘附实验观察缺氧对照组和不同浓度的健脾化瘀方对缺氧诱导的结肠癌细胞SW480细胞株黏附能力的影响;采用细胞黏附人工重组基底膜培养小室法（Transwell小室）比较缺氧组和健脾化瘀方对缺氧诱导的结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响;采用实时荧光定量PCR法(realtime PCR)和蛋白质印迹法(Western Bolt)检测健脾化瘀方对缺氧诱导的结肠癌细胞SW480细胞株上皮细胞-间质化(EMT)相关基因(HIF-1α蛋白、转录因子Snail、E-钙黏蛋白(epithelial-cadherin，E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达的影响。
　　结果：
　　1、使用不同浓度的CoCl2诱导结肠癌SW480细胞株缺氧后细胞增殖能力逐渐减弱，各浓度抑制率差异有统计学意义(P＜0.05):高浓度的健脾化瘀方对缺氧诱导的结肠癌SW480细胞有明显抑制其增殖能力的作用，较中低剂量的给药浓度差异明显，其差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　2、缺氧诱导的结肠癌SW480细胞较空白组黏附能力明显增强;不同浓度的健脾化瘀方作用于缺氧诱导的结肠癌SW480细胞后，细胞黏附能力明显下降，并且呈现时间依赖性。
　　3、缺氧诱导的结肠癌SW480细胞侵袭能力较空白组明显增强;不同浓度的健脾化瘀方在对缺氧诱导的人结肠癌细胞SW480给药24h后发现，与对照组相比，能显著抑制SW480细胞的侵袭能力，当浓度达到0.4mg/ml以及0.8mg/ml时，倒置显微镜下显示穿过小室的细胞数量较对照组明显稀少，且呈浓度依赖关系。
　　4、实时荧光定量PCR法以及蛋白质印迹法实验显示:与缺氧对照组相比，缺氧诱导因子(HIF-1α)、波形蛋白(Vimentin)及转录因子Snail mRNA和蛋白在结肠癌SW480细胞中的表达随着健脾化瘀方浓度的升高而逐渐降低;E-钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA和蛋白在结肠癌SW480细胞中的表达随着健脾化瘀方浓度的升高而逐渐增加。
　　结论：
　　1、CoCl2化学模拟缺氧微环境下的结肠癌细胞SW480细胞增殖能力明显下降;不同浓度的健脾化瘀方对缺氧微环境下的结肠癌细胞增殖抑制能力有一定增强作用，其对浓度有一定依赖性。
　　2、缺氧微环境下结肠癌细胞SW480细胞黏附及侵袭能力明显增强，不同浓度的健脾化瘀方作用于缺氧微环境下的结肠癌SW480细胞后黏附及侵袭能力下降，且随着时间的推移逐渐减弱。
　　3、健脾化瘀方抑制缺氧微环境下结肠癌SW480细胞侵袭转移的作用机制可能与逆转上皮细胞-间质化转变有关:下调HIF-1α、Vimentin及转录因子Snail基因和蛋白的表达;上调E-cadherin基因和蛋白的表达。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 理论研究

1．祖国传统医学对大肠癌的研究进展

1．1 病因病机

1．2 治疗

2．现代医学对大肠癌的研究进展

2．1 病因及发病机制

2．3 治疗

3．肿瘤微环境中缺氧相关因素的研究进展

4．大肠癌细胞上皮间质转化(EMT)与大肠癌转移的关联性

第二部分 实验研究

1．健脾化瘀方对缺氧诱导的结肠癌SW480细胞增殖抑制影响

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

2 健脾化瘀方对缺氧诱导的人结肠癌SW480细胞黏附能力的影响

2．1 实验材料

2．2 方法与步骤

2．3 结果

2．4 讨论

3 健脾化瘀方对缺氧诱导的人结肠癌SW480细胞侵袭能力的影响

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果

3．4 讨论

4 健脾化瘀方对缺氧诱导的SW480细胞侵袭转移机制的研究

4．1 细胞总RNA的提取及RT-PCR实验

4．2 细胞总蛋白的提取及Western Bolt实验

4．3 统计学分析

4．4 结果

第三部分 讨论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢