默克尔细胞局部注射联合MEBO外用对大鼠足底创面神经再生的实验研究

摘要

目的：
　　通过对SD大鼠默克尔细胞（merkel cell，MCs）的提取、分离、培养及鉴定，观察局部注射MCs联合美宝湿润烧伤膏（MEBO）外用对大鼠足底创面神经再生的影响。
　　方法：
　　1)取新生SD大鼠（1～3d）足垫、须垫及背部皮肤，采用酶消化法分离提取MCs,接种于多聚赖氨酸（PLL）包被的培养瓶内，通过细胞免疫组织化学法测定细胞角蛋白CK20的表达，qPCR检测MCs中Piezo2 mRNA的表达，ELISA法检测培养第2d、4d、6d、8d、10d细胞分泌CGRP情况。
　　2)建立SD大鼠足底创面模型，按照干预方式的不同分为如下五组：A组（MCs注射+MEBO组）；B组（MCs局部注射组）；C组（MEBO外用组）；D组（阴性对照组）；E组（鼠神经生长因子注射阳性对照组）。细胞组用MCs1×106个/mL分别注射于创面基底中央及创缘3、6、9、12点标记处，24小时后追加1次，每次每个部位25μL；MEBO组按相应分组给予MEBO外用，每日换药一次，直至创面愈合。阳性及空白对照组分别予等体积鼠神经生长因子及PBS注射。观察创面愈合时间，计算各组创面各时间点愈合率，棉拭子检测足底感觉恢复情况，分别于干预后7d、14d、21d三个时相各组分别随机抽取6只大鼠，切取组织，制作石蜡切片，免疫荧光染色观察新生皮肤神经纤维生长情况。
　　3）每组大鼠均于造模后第7d、14d、21d时用棉拭子检测大鼠足底缩足反射，记录、统计缩足次数并计算百分比。
　　结果：
　　1）采用中性蛋白酶和胰酶依次消化SD大鼠足底及须垫部位所取皮肤组织可得到较多MCs，以CK20做细胞免疫化学染色可见MCs呈阳性反应。
　　2）实验中应用中性蛋白酶及胰酶双酶消化法可得到MCs，以Ham,s F-12培养基为基础培养基，加入20ng/ml bFGF可使MCs稳定增殖；qPCR结果示MCs中Piezo2 mRNA的表达量为：0.0270±0.0042；酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测检测MCs上清液中降钙素基因相关肽（CGRP)在培养第2、4、6、8、10天浓度随培养时间的延长逐渐增加，培养第6d到8d时增加速率更快，间接提示默克尔细胞增殖情况。
　　3）创面愈合方面，大体观察肿胀程度及炎性反应程度无明显区别，总愈合时间上应用MEBO的两组创面较其他实验组提前，A组～E组愈合时间分别为14.33±0.69天、16.44±0.86天、14.83±0.71天、17.44±0.98天、16.27±0.67天。在同时间点创面愈合率上，A组和C组优于其他对照组（P＜0.05），到21d时各组创面均全部愈合。在缩足反射比较上，除E组外，A组较其他三组反射阈值更低、对刺激更敏感(P＜0.05)，提示默克尔细胞联合MEBO应用有促进大鼠足底创面神经再生的作用。
　　4）创面新生皮肤免疫荧光染色显示示A组在神经纤维数量较多、排列有序，优于阴性对照或单一实验处理组，与阳性对照组（E组）相近。
　　结论：
　　1）中性蛋白酶及胰酶双酶消化法是获取大鼠MCs的有效方法，在加入bFGF的Ham,s F-12培养基的体系中培养的MCs大量增殖。
　　2）MCs局部注射联合MEBO外用可缩短创面愈合时间、促进创面皮肤神经的再生。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

第一部分 默克尔细胞的分离培养、鉴定及piezo2mRNA检测

1 材料与方法

2 结果

3.讨论

4 结论

第二部分 默克尔细胞局部注射联合MEBO外用在大鼠足底创面神经再生的实验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

综述:默克尔细胞在皮肤触觉形成方面的研究进展

致谢

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