Lonp1在熊果酸保护赭曲霉毒素A致HEK293T细胞氧化应激中的作用及机制探索

摘要

目的：Lonp1是OTA诱导的肾脏毒性涉及的重要蛋白之一。基于UA的护肾作用，本研究主要通过抑制Lonp1的表达来探索Lonp1与UA的护肾作用的关系及可能作用机制。 方法：1、采用半贴壁细胞培养法，按实验分组分别用OTA、UA独立处理HEK293T细胞。通过倒置显微镜观察细胞形态变化及CCK-8法测定细胞存活率，确定OTA和UA 各自的工作浓度。2、设置以下实验分组：空白对照组（C 组）、UA 对照组（U组）、OTA 对照组（O 组）、UA 预处理组（U+组）、UA 后处理组（O+组）、同时处理组（U&O组），按暴露时间顺序，依次用OTA和UA处理HEK293T细胞，确定UA的护肾模式。3、基于本实验中UA的最佳护肾作用，设置Lonp1抑制剂CDDO-me对照组（C-组）和抑制剂处理组（C+组），判断Lonp1的表达与UA的护肾作用的关系。4、综合2、3中的实验分组，采用DCFH-DA试剂盒检测细胞内ROS含量，Western Blot技术检测Lonp1、Aco2、HSP75、p-mTOR和LC3等蛋白的表达，通过分析其相关性，探索Lonp1的表达在UA的护肾作用中的可能作用机制。 结果：1、CCK-8结果显示：在不同浓度OTA处理24 h后，各浓度组细胞存活率随OTA浓度的增加而降低，8μM OTA组细胞死亡率为50.6%，达半数抑制浓度，且相关文献证实该浓度可对细胞线粒体造成损伤，从而选择8μM OTA进行后续实验[1]。不同浓度的UA处理细胞2 h, 各浓度组细胞存活率随OTA浓度的增加而减小，与对照组相比，1μM UA显示强促增殖作用，故选择1μM UA进行后续实验。2、U+组、O+组和U&O组较O组均显示不同程度的保护作用，其中U+组与O+组、U&O组相比，细胞存活力提高36%，具更显著的保护作用。倒置显微镜观察结果显示：C组和U组健康HEK293T细胞呈圆梭型增殖，单个胞体立体饱满，突触呈纺锤形，细胞数量达生长面积的90%；较C、U两组，O组、U+组、O+组和U&O组细胞生长阻滞，突触消失，胞体皱缩形成大量空泡，培养基质中出现大量细胞碎片。3、DCFH-DA试剂盒检测不同处理组细胞的ROS生成水平。较空白对照组和1μM UA处理组，8μM OTA可诱导细胞生成较高水平的ROS，差异有统计学意义（P<0.05），提示OTA可能通过氧化应激途径诱导肾毒性。其余OTA和UA联合暴露的三组，U+、U&O、O+组较O组，细胞ROS水平均显示不同程度的降低，其中U+组的抑制ROS生成效果最好。意味着1μM UA预处理能够保护细胞减缓OTA诱导的ROS损伤。WB检测不同处理组细胞中各蛋白的表达结果中，磷酸化mTOR作为自噬负向信号蛋白，在OTA诱导的强氧化应激下，其表达程度指示自噬水平提高，通过LC3的表达也验证了这一点。提示细胞在该水平应激下正在激活相关信号途径和代谢做出代偿反应。同时这种代偿可能与细胞内ROS的生成水平相关联。而Lonp1和Aco2，Hsp75的表达趋势基本一致，较正常环境和弱应激条件，他们在强应激水平下其表达相对降低，提示在OTA诱导的细胞氧化损伤中，Lonp1可通过行使其水解酶和伴侣职能，与其底物Aco2和分子伴侣HSP75共同参与到UA对OTA诱导的细胞损伤保护过程。 结论：1、UA的最佳护肾模式为预处理保护模式。2、Lonp1的表达与UA的护肾作用有关系。3、在UA保护OTA诱导的肾细胞氧化损伤中，Lonp1可能通过行使其水解酶和伴侣职能，与其底物Aco2和分子伴侣HSP75参与到UA对OTA诱导的细胞损伤保护过程,在不同的氧化应激水平下，直接或间接参与细胞的自噬进程，在这个保护模型中发挥作用。

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