钙离子在蓝光诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡中的作用机制研究

摘要

目的：探讨蓝光诱导人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial cells，RPE）细胞凋亡过程中，胞内钙离子（Ca2+）在Ca2+-PKC信号传导通路及与线粒体损伤的凋亡途径的相关作用机制。
　　方法：原代培养健康人 RPE细胞，传至第3-6代用于本实验。采用蓝光（470nm-490nm），光照强度为（2,000±500）lx，经蓝光照射时间6h后，继续培养细胞24h，建立蓝光损伤人RPE细胞模型。采用免疫组化(IHC)染色光学显微镜下鉴定凋亡细胞，通过透射电镜（TEM）观察RPE的核型变和线粒体形态学改变。将体外培养的人RPE细胞随机分成4组：1A组：无光照组；1B组：光照组；1C组：光照+硝苯地平（Nifedipine）组；1D组：光照+（-）BayK8644组。采用RT-PCR技术测定细胞膜L-型钙通道（L-type calcium channel）α1C、α1D、α1F亚型的mRNA表达量。将体外培养的人RPE细胞随机分成5组：2A组：无光照组；2B组：光照组；2C组：光照+硝苯地平组；2D组：光照+钙磷酸结合蛋白（Calphostin C）组；2E组：光照+佛波酯（PMA）组。激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）用于检测各组RPE细胞内游离Ca2+浓度，分析荧光强度。采用非放射性核素法检测RPE胞内PKC活性。采用Western blot法测定各组RPE胞内Caspase-9蛋白的表达。将体外培养的人RPE细胞随机分为3组，3A组：（500±100）lx、（2,000±500）lx、（3,000±500）lx光照强度，光照时间6h，光照后细胞终止培养时间24h；3B组：（2,000±500）lx光照强度，光照时间3h、6h、12h、24h，，光照后细胞终止培养时间24h；3C组：（2,000±500）lx光照强度，光照时间6h，光照后细胞终止培养时间6h、12h、24h、36h和48h；对照组：无光照组，流式细胞术用于检测细胞线粒体跨膜电位（ΔψM）。将体外培养的人RPE细胞随机分为2组：4A组：光照强度（2,000±500）lx，光照时间6h，光照后细胞终止培养时间6、12、24、36h；4B组：光照强度（2,000±500）lx，光照时间12h，光照后细胞终止培养时间6h、12h、24h和36h，酶联免疫吸附试验（ELISA）测定细胞色素C（Cyt C）浓度。将体外培养的人RPE细胞分成2组：5A组：无光照组；5B组：单纯光照组，Western blot法测定Bax、Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达量。采用SPSS20.0统计学软件对实验数据进行统计学分析。
　　结果：体外培养的人RPE细胞在蓝光（470-490nm），光照强度（2000±500）lx，光照时间6h，光照后细胞终止培养时间24h后出现细胞凋亡，IHC染色表现为细胞核浓缩、染色质边聚成新月形、细胞核碎裂成数个；透射电子显微镜下观察可见线粒体膜破碎，嵴完全消失，染色质聚核膜边并浓集，呈现典型的细胞凋亡核型变。RT-PCR测定L-型膜型钙通道的α1C、α1D、α1F亚基mRNA表达量比较，差异均有统计学意义（F=45.92，P＜0.05；F=50.32，P＜0.05；F=18.50，P＜0.05）。LSCM检测RPE细胞内游离Ca2+浓度结果显示，光照组（2E组＞2B组＞2D组＞2C组，P＜0.05）均高于无光照组（2A组），差异具有统计学意义（F=26764.22，P＜0.05）。非放射性核素法检测RPE细胞内PKC活性结果显示，光照组（2B组）IA值明显高于对照组（2A组）IA值（t=9.869，P＜0.05）。胞内Ca2+浓度与PKC活性通过线性回归分析显示：胞内Ca2+与PKC呈正相关关系（Y=53.032X+127.565，其中：r=0.990, t=13.931, P＜0.05）。Western blot法测定各组RPE细胞内caspase-9蛋白相对表达量显示，2B、2D、2E组与2A组比较，caspase-9蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）。流式细胞术检测细胞线粒体膜电位（ΔψM）显示：3A组随着光照强度增加，RPE线粒体膜电位（ΔψM）开始下降（P＜0.05）；3B组中光照6h、12h组与对照组比较，RPE线粒体膜电位（ΔψM）明显下降（P＜0.05）；3C组中的光照6h、12h、24h、36h、48h与对照组比较，RPE线粒体膜电位（ΔψM）明显下降（P＜0.05）。ELISA法测定Cyt C结果显示：4A组：光照6h处理继续培养的24h、36h组与对照组、6h、12h组比较， Cyt C浓度明显增加（P＜0.05）。4B组：光照12h处理继续培养12h、24h、36h组与对照组比较，Cyt C浓度明显增加（P＜0.05）。Western blot法测定Bax、Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达量，结果显示：光照组（5B组）RPE细胞与无光照组（5A组）比较，Bax表达量增加，而Bcl-2、Bcl-xl表达量下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），且Bax/Bcl-2值、Bax/Bcl-xl值与无光照组比较，明显高于无光照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：蓝光可诱导人RPE细胞凋亡，出现典型的细胞凋亡核型变和胞内线粒体损伤。蓝光照射后可引起RPE细胞膜L-型钙通道α1C、α1D、α1F亚基的mRNA表达增高，细胞内Ca2+荧光强度及PKC活性不同程度增强，且胞内Ca2+浓度及PKC活性呈正相关关系。与此同时，蓝光照射后RPE细胞线粒体膜电位（ΔψM）明显下降，Cyt C大量释放，促凋亡因子Bax与抑凋亡因子Bcl-2、Bcl-xl比值下调，触发caspase-9蛋白相对表达量增加，最终诱导细胞凋亡。钙离子同时参与Ca2+-PKC信号传导通路促凋亡过程及细胞线粒体凋亡途径，并起着启动、调控、促进细胞凋亡的关键作用。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

第一部分：Ca2+-PKC信号传导通路在蓝光诱导人RPE细胞凋亡过程中的作用

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂、仪器

1.2 方法

1.3 统计学方法

2 结果

2.1蓝光照射后体外培养的人RPE细胞凋亡观察

2.2 RPE细胞L-型钙通道中α1C、α1D、α1F亚基mRNA表达量

2.3 RPE细胞内游离Ca2+浓度检测结果

2.4 RPE细胞内PKC活性检测结果

2.5蓝光照射后RPE细胞内游离Ca2+浓度与PKC活性的关系

2.6 RPE细胞内Caspase-9蛋白相对表达量检测结果

第二部分：Ca2+启动线粒体凋亡途径在蓝光诱导人RPE细胞凋亡过程中的作用

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂、仪器

1.2方法

1.3统计学方法

2 结果

2.1 RPE细胞凋亡及线粒体形态学改变

2.2 线粒体膜电位（ΔψM）检测

2.3 线粒体细胞色素C检测结果

2.4 Bax、Bcl-2、Bcl-xl蛋白的表达

3 讨论

4 结论

参考文献

综述:钙离子在蓝光诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡中的作用机制研究进展

致谢

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