基于Nrf2/ARE信号途径设计天然产物导向的癌预防和神经保护试剂及其作用机制研究

摘要

氧化应激被认为是导致癌症和神经退行性疾病的重要因素。激活 Nrf2/ARE信号通路不仅是细胞抵御氧化应激的重要机制，而且是发展间接抗氧化剂、癌预防和神经保护试剂的有效策略；然而，该通路具有“双刃剑”的角色，癌细胞中组成性高表达 Nrf2，又是其对化疗药物产生耐药性的重要原因。因此设计和发现Nrf2的激活剂和抑制剂对抗癌试剂的研发都具有重要的意义。基于Nrf2的伴侣分子Keap1具有高亲核活性的半胱氨酸残基，本论文以天然产物白藜芦醇，姜黄素和荜茇酰胺为先导分子，从氧化电位和亲电性等角度设计其类似物。选择氧化应激诱导的细胞损伤模型研究它们作为 Nrf2激活剂使细胞实现适应性保护的结构基础和化学生物学机制。此外，我们发现异甘草素能够作为 Nrf2抑制剂和顺铂的敏化剂，协同诱导耐药的癌细胞死亡。主要内容和创新点总结如下：
　　（1）邻苯二酚结构单元广泛存在于饮食类天然产物中，而它们往往具有显著的癌预防活性。尽管目前已知该单元氧化成邻醌可能是其发挥癌预防活性关键步骤，但是其胞内转化的机理并未澄清。以叔丁基氢过氧化物（t-BHP）诱导的HepG2细胞氧化损伤作为模型，我们发现，在所选择的白藜芦醇及其羟基化类似物中，仅仅具有邻苯二酚结构单元的3,4-DHS能够诱导细胞产生适应性保护。机制研究表明：3,4-DHS可通过促进Akt的磷酸化，诱导Keap1的半胱氨酸残基修饰，抑制Nrf2泛素化并促进其核转位，从而激活Nrf2信号通路以及诱导随后的二相代谢酶表达实现细胞保护。值得注意的是，上述所有过程均可通过竞争的亲核试剂二硫苏糖醇和铜离子的特异性螯合剂新亚铜废除。该工作证实：3,4-DHS能够作为亲电前体，在胞内利用铜离子转化为邻醌亲电体，成为 Nrf2激活剂。这种铜离子介导的氧化反应对于其激活 Nrf2和诱导二相代谢酶表达以及最终的细胞保护是不可或缺的。这一发现揭示了胞内铜离子的一种尚未公认的角色，即对具有邻苯二酚结构单元的饮食类天然产物所具有的癌预防活性的贡献。该发现不仅有助于理解这些天然产物为什么具有显著的癌预防活性，而且提供了利用该结构单元进一步设计多酚类导向的Nrf2激活剂的重要信息。
　　（2）基于认识到胞内铜离子介导的3,4-DHS的氧化是其作为Nrf2激活剂的关键步骤，因此我们在保留邻苯二酚结构单元的基础上，从降低氧化电位，提高亲脂性以及增强铜离子螯合能力的角度，设计了其共轭链延长的类似物3,4-DHD。我们选择6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的PC12神经细胞氧化损伤模型，发现：3,4-DHD是优于3,4-DHS的Nrf2激活剂和神经保护试剂。
　　（3）我们以姜黄素为先导分子，从提高稳定性和亲电性的角度，设计了邻位双三氟甲基取代的五碳单元类似物 A1。发现：该分子呈现出比母体分子显著更高的Nrf2激活和神经保护活性；其还原类似物 RA1完全失活，表明 A1的Michael受体单元是其作为 Nrf2激活剂的结构基础。其机制包括：A1凭借其Michael受体单元促进Akt的磷酸化、共价修饰Keap1，抑制Nrf2泛素化并促进其核转位，激活 Nrf2信号通路以及诱导随后的二相代谢酶表达，最终实现细胞保护。
　　（4）我们以荜茇酰胺为先导分子，基于提高药物代谢稳定性和亲脂性的考虑，在其苯环上不同位置引入三氟甲基，在此基础上，为提高其亲电性，在其内酰胺环上的Michael受体单元的α-位引入吸电子的氯原子。据此我们发现了荜茇酰胺导向的Nrf2激活剂和神经保护试剂PLCl-4CF3。其激活Nrf2的机制与姜黄素类似物A1类似，但与激酶途径调节无关。
　　（5）我们以顺铂耐药的人卵巢癌细胞SKOV3/DDP细胞作为模型，发现异甘草素能够通过抑制 Nrf2/ARE信号通路逆转该细胞对顺铂的耐药性。其抑制Nrf2的机制至少与两种蛋白质翻译后修饰有关，即抑制Akt的磷酸化和加强Nrf2的泛素化。

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第一章 背景介绍

1.1 Nrf2/ARE途径的一般组成部分

1.2 Nrf2/ARE信号通路的调控

1.3. Nrf2/ARE信号通路与人类疾病

1.4 Nrf2/ARE信号通路调节剂

1.5 Nrf2/ARE 信号通路与自噬的关系

1.6 课题拟解决的科学问题及其意义

参考文献

第二章 通过铜离子和邻醌介导的邻苯二酚型白藜芦醇类似物对Nrf2的激活理解该结构在癌症预防中的角色

2.1 摘要

2.2 引言

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

2.6 材料与方法

参考文献

第三章 通过延长白藜芦醇类似物3,4-DHS的共轭链发现更加有效的Nrf2/ARE信号通路激活剂作为潜在的神经保护试剂

3.1 摘要

3.2 引言

3.3 结果与讨论

3.4 小结

3.5 材料与方法

参考文献

第四章 姜黄素导向的神经保护试剂的设计及其机制研究

4.1 摘要

4.2 引言

4.3结果

4.4 讨论

4.5 小结

4.6 材料与方法

参考文献

第五章 荜茇酰胺导向的神经保护试剂的设计及其机制研究

5.1 摘要

5.2 引言

5.3 结果与讨论

5.4小结

5.5 材料与方法

参考文献

第六章 异甘草素通过抑制Nrf2/ARE信号通路敏化人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP的作用机制研究

6.1摘要

6.2引言

6.3 结果

6.4 讨论

6.5小结

6.6 材料与方法

参考文献

第七章 总结与展望

7.1 全文总结和意义

7.2 今后研究工作展望

参考文献

在学期间的研究成果

致谢