丙烯腈诱导的氧化应激对雄性大鼠睾丸细胞NF-κB信号通路影响的研究

摘要

目的：探索丙烯腈（Acrylonitrile，ACN）引起雄性大鼠睾丸氧化应激对NF-κB信号通路的影响，以及NF-κB激活后对凋亡相关基因的调节作用，为进一步研究ACN的睾丸生殖毒性机制提供依据。
　　方法：将50只SPF级健康成年SD雄性大鼠，按体重随机分为5组，每组10只，饲养于甘肃中医药大学SPF级实验动物中心，自由进食及饮水，适应性饲养一周后，以12.5、25、50 mg/kg ACN、50 mg/kg ACN+300 mg/kg N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）灌胃，联合组NAC灌胃30分钟后再灌ACN，对照组大鼠给予等体积玉米油，1次/天，6天/周，共13周。每隔3天监测一次体重，末次采血后处死动物。（1）分离大鼠睾丸、附睾等脏器并称重，计算脏器系数。（2）制备睾丸HE染色病理切片，光镜下观察睾丸组织结构改变。（3）可见光分光光度法检测睾丸组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）、丙二醛（MDA）。（4）免疫荧光染色法检测睾丸核因子-κB（NF-κB）激活及核转移。（5）Real-Time PCR检测睾丸Bax、Bcl-2基因表达情况。（6）Western Blot检测睾丸p65、IKK、IκB、p-IκB、Bax、Bcl-2蛋白表达情况。
　　结果：（1）实验开始前及染毒过程中各剂量组大鼠体重之间比较均无显著性差异（P>0.05）。中、高剂量染毒组大鼠睾丸脏器系数与对照组比较显著降低（P<0.05）。各剂量组间大鼠附睾脏器系数比较无显著性差异（P>0.05）。（2）光镜下可见，中剂量染毒组大鼠睾丸曲细精管密集程度较低，初级精母细胞染色程度丰富、数量较多，睾丸间质细胞较少，轮廓较清晰。高剂量染毒组大鼠睾丸曲细精管排列稀疏，密集程度低，管径变小，各级生精细胞排列不规则，数量少，睾丸间质稀疏、间质细胞数量少、轮廓不清晰。（3）低、高剂量染毒组大鼠睾丸GSH/GSSG比值、GSH-Px酶活性与对照组比较显著降低（P<0.05）。中、高剂量染毒组大鼠睾丸 MDA含量与对照组比较显著升高（P<0.05）。NAC预处理后，高ACN+NAC组大鼠睾丸MDA含量与高ACN组比较显著降低（P<0.05）；高ACN+NAC组大鼠睾丸GSH/GSSG比值与高ACN组比较显著升高（P<0.05）；（4）免疫荧光结果显示，高ACN组大鼠睾丸p65蛋白表达升高，转移入细胞核p65升高，表明高ACN组大鼠睾丸NF-κB被激活。用NAC提前处理后p65蛋白表达及核转移显著减少。Western Blot结果示，高剂量染毒组大鼠睾丸IKK-α/β蛋白、p65蛋白、p-IκB蛋白表达与对照组比较显著升高（P<0.05），IκB蛋白表达与对照组比较显著降低（P<0.05）。高 ACN+NAC联合染毒组大鼠睾丸 IKK-α/β蛋白、p65蛋白、p-IκB蛋白表达与高ACN组比较显著降低（P<0.05），IκB蛋白表达与高ACN组比较显著升高（P<0.05）。（5）RT-PCR和Western Blot结果示，高剂量染毒组大鼠睾丸 Bax mRNA及蛋白表达水平与对照组比较显著升高（P<0.05）。高剂量染毒组大鼠睾丸 Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。高ACN+NAC联合染毒组大鼠睾丸Bax mRNA及蛋白表达水平与高ACN组比较显著降低（P<0.05）。
　　结论：（1）ACN亚慢性染毒可引起大鼠睾丸发生病理性损伤。（2）ACN引起的睾丸损伤可能与氧化应激有关。（3）ACN诱导睾丸细胞发生氧化应激，激活了NF-κB信号通路，上调了促凋亡基因Bax表达，这可能是大鼠睾丸细胞发生凋亡的机制之一。

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第一章 前言

1.1 概述

1.2 ACN的一般毒性及致癌性

1.3 ACN的生殖系统毒性

1.4 ACN引起生殖损伤的机制研究

第二章 材料与方法

2.1 实验动物及分组

2.2 实验试剂及实验仪器

2.3 技术路线图

2.4 体重及脏器系数的称量

2.5 氧化还原相关酶的测定

2.6 睾丸组织HE染色病理切片制备

2.7 NF-κB激活-核转录免疫荧光检测步骤

2.8 Western Blot检测步骤

2.9 RT-PCR检测步骤

2.10 统计分析

第三章 结果

3.1体重及脏器系数

3.2 病理学改变

3.3 ACN染毒对大鼠睾丸抗氧化能力及脂质过氧化的影响

3.4 NAC对ACN引起睾丸氧化损伤的干预作用

3.5 ACN染毒及NAC干预后对大鼠睾丸NF-κB信号通路的影响

3.6 ACN染毒及NAC干预后大鼠睾丸Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白变化

第四章 讨论

4.1 ACN对大鼠睾丸脏器系数及组织病理学影响

4.2 ACN诱导大鼠睾丸氧化应激及NAC的干预作用

4.3氧化应激激活NF-κB信号通路的机制探讨

4.4 NF-κB信号通路激活后对凋亡相关基因表达的调节作用

第五章 结论

不足之处及展望

一、不足之处

二、展望

参考文献

在学期间的研究成果

致谢

附录