改变microRNA-21的表达在人肺癌细胞体外生长和迁移中的作用研究

摘要

目的：观察改变miRNA-21表达对人肺癌细胞体外生长和迁移中的作用，并探讨其分子机制。
　　方法：⑴利用分子克隆技术构建 miRNA-21过表达载体（命名为 p-miR-21）；体外将p-miR-21和前期构建的pcDNA-6.2-miRNA-21-ASOs（命名为p-miR-21-ASOs）载体瞬时转染入人肺癌95D细胞中；Real-time PCR技术检测miR-21成熟体的表达水平，肿瘤细胞生长周期相关的周期蛋白依赖性激酶 CDK2、CDK3、CDK4和 CDK6，以及肿瘤细胞转移相关分子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表达变化；利用CCK-8和Scratch assay检测改变miR-21表达对人肺癌95D细胞体外增殖和迁移的影响；利用Transwell技术检测95D细胞的迁移和侵袭能力变化；最后利用Western blot检测相关信号途径，包括Akt/mTOR、Erk等途径的传递改变。⑵运用生物信息学技术初步筛选出miR-21可能的候选靶分子；Real-time PCR检测p-miR-21-ASOs和 p-miR-21转染入人肺癌95D细胞后，候选靶分子的表达变化；Western blot技术验证其表达。利用RNAi技术合成miR-21靶分子LEMD3的RNAi干扰序列（命名为si-LEMD3），体外瞬时转染入人肺癌95D细胞；Real-time PCR和Western blot技术检测细胞中LEMD3的表达变化；CCK-8法和Scratch assay观察干扰LEMD3表达后对95D细胞体外增殖和迁移的影响；克隆形成实验观察细胞克隆形成能力的改变；Real-time PCR技术检测细胞中生长周期相关的周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和 CDK6，以及肿瘤细胞转移相关分子 MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表达变化；最后，利用Western blot检测相关信号途径，包括Akt/mTOR、Erk等途径的传递改变。随后，将p-miR-21-ASOs载体（4μg）和si-LEMD3干扰序列（50 nM）共转染入人肺癌95D细胞中；CCK-8法和Scratch assay法观察人肺癌95D细胞体外增殖和迁移的影响；克隆形成实验观察95D细胞克隆形成能力的改变；Real-time PCR检测细胞中生长周期相关的周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达变化以及转移相关分子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4等的表达变化；最后，利用Western blot技术检测LEMD3蛋白、磷酸化Akt、磷酸化Erk以及总Akt、Erk蛋白的表达水平。
　　结果：①经鉴定成功构建 miRNA-21过表达载体 p-miR-21；与 p-Cont对照组相比， p-miR-21-ASOs转染组中miR-21的表达显著下调(P＜0.05)，而p-miR-21转染组中的表达显著上调(P＜0.05)；且 p-miR-21-ASOs转染组肿瘤细胞数随着剂量的增加逐渐减少(P＜0.05)，而p-miR-21转染组中肿瘤细胞数随着剂量的增加逐渐增多(P＜0.05)；与p-Cont组相比，p-miR-21-ASOs转染组95D细胞的增殖和迁移能力均明显降低(P＜0.05)，而p-miR-21转染组中95D细胞则明显增强(P＜0.05)；与p-Cont对照组相比，p-miR-21-ASOs转染组细胞的侵袭和迁移数减少，而 p-miR-21转染组细胞的则增多(P＜0.05)；与p-Cont对照组相比，p-miR-21-ASOs转染组中95D细胞生长周期相关的周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达均显著下调(P＜0.05)，而p-miR-21转染组中的表达均显著上调(P＜0.05)，此外，p-miR-21-ASOs转染组中肿瘤细胞转移相关分子 E-cadherin的表达上调，MMP-2、MMP-9和 CXCR4的表达均下调(P＜0.05)，而 p-miR-21转染组中 E-cadherin的表达下调，MMP-2、MMP-9和CXCR4的表达均显著上调(P＜0.05)； p-miR-21-ASOs转染组中95D细胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表达均明显下调(P＜0.05)，而p-miR-21转染组细胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表达均明显上调(P＜0.05)。②筛选出miR-21的候选10个靶分子，p-miR-21-ASOs转染组95D细胞中抑癌靶基因SOCS6、HBP1、PTEN、PDCD4、RECK、SPRY1、TIMP3明显上调(P＜0.05)，促癌靶基因 TIAM1、PIK3R1、HIF1α明显下调的(P＜0.05)；与之相反，p-miR-21转染组中的这些抑癌靶基因是下调的(P＜0.05)，而促癌靶基因均明显上调(P＜0.05)；结合相关文献报道，筛选出miR-21可能的新候选靶分子LEMD3；与p-Cont组相比， p-miR-21-ASOs转染组 LEMD3的表达均表达上调(P＜0.05)；而 p-miR-21转染组LEMD3的表达均表达下调(P＜0.05)，提示LEMD3为miR-21的新靶分子。si-LEMD3转染组中的LEMD3 mRNA水平和蛋白表达均表达下调(P＜0.05)，且细胞数较Control组明显增加；与Control组相比，si-LEMD3转染组95D细胞的增殖和迁移能力均明显增强(P＜0.05)，且肿瘤细胞克隆形成能力明显增加(P＜0.05)；与Control对照组相比，si-LEMD3转染组中95D细胞生长周期相关的周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达均显著上调(P＜0.05)，而肿瘤细胞转移相关分子除E-cadherin的mRNA下调外，其余三个MMP-2、MMP-9和CXCR4的mRNA均表达上调(P＜0.05)；与Control对照组相比，si-LEMD3转染组95D细胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表达均明显上调(P＜0.05)。与 p-miR-21-ASOs+si-control对照组相比， p-miR-21-ASOs和si-LEMD3共转染组95D细胞中LEMD3蛋白表达均明显减少(P＜0.05)；且细胞数显著增多；与 p-miR-21-ASOs+si-control对照组相比， p-miR-21-ASOs+si-LEMD3转染组95D细胞的增殖和迁移能力均显著增强(P＜0.05)，同时肿瘤细胞克隆形成能力明显增加(P＜0.05)；与p-miR-21-ASOs+si-cont对照组相比，p-miR-21-ASOs+si-cont转染组中95D细胞CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达均显著上调，差异具有统计学意义(P＜0.05)，肿瘤细胞转移相关分子除E-cadherin的mRNA均表达下调，其余三个MMP-2、MMP-9和CXCR4的mRNA均表达上调(P＜0.05)；与 p-miR-21-ASOs+si-control对照组相比，p-miR-21-ASOs+si-LEMD3转染组95D细胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表达均明显上调，且具有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：⑴改变miR-21的表达可显著影响人肺癌细胞的体外生长和迁移，提示miR-21可能是人肺癌基因治疗的潜在新靶标之一。⑵miR-21调控人肺癌细胞体外生长与迁移的效应与其靶分子LEMD3表达改变有关，涉及Akt、Erk等相关信号途径传递的变化。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

第一章 改变miR-21表达对人肺癌细胞体外生长和迁移的影响

0引言

1 实验材料

1实验方法

3 结果

4 讨论

5结论

第二章 改变miR-21表达影响人肺癌细胞体外生长和迁移的分子机制

0引言

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

综述:微小RNA-21与NSCLC关系的研究新进展

致谢

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