针对变异链球菌的人源STAMP(C16LL-37)的生物学特性

摘要

龋病是最为常见的口腔慢性进行性感染性的疾病。变异链球菌(Streptococcus mutans，s.mutans)为龋病主要的致病菌。因此，减少变异链球菌的增殖对阻断龋病的发生及发展具有重大意义。特异性靶向抗菌肽(Specifically targeted antimicro-bial peptides。STAMPs)由靶向定位区域(KH)、抗菌区域(AMP)和(或)连接体区域组成，其可通过KH区域增高目标细菌表面抗菌肽的浓度，使其杀伤效力及动态性能全面提升。至今。LL-37是人体内仅被发现的一种具备α-螺旋结构的Cathelicidins抗菌肽，广泛分布于皮肤、口腔、精液及创伤部位等，具备极高的生物安全性，且不易导致病原菌发生抗性突变，为新一种抗生素设计及合成的理想原料。此外，已有研究者以变异链球菌(非)依赖感受态刺激肽(Competence stimulating peptide。CSP) C端16个氨基酸序列(TFFRLFNRSFTQALGK)即CSPC16作为STAMP的KH区域，成功地合成了具备靶向特异性的新型抗生素。因此，本研究拟以变异链球菌CSP的C端16个氨基酸序列(CSPC16)为KH区域，以人源抗菌肽LL-37的整条氨基酸序列为AMP区域，两者通过连接体(-GGG-)连接，合成人源特异性靶向抗菌肽C16LL-37并对其相关生物学特性进行研究。
　　方法：通过标准固相合成技术(Fmoc保护法)合成人源抗菌肽 LL-37、CSPC16(变异链球菌感受态刺激肽(Competence stimulating peptide。CSP) C端16个氨基酸组成的多肽)及二者的重组多肽C16LL-37；以LL-37、CSPC16及其它四种细菌（Actinomyces viscosus。A.viscosus ATCC15987、Escherichia coli。E.coli ATCC25922、Staphylococcus aureus。S.aureus ATCC4356、Lactobacillus acidophilus。L.acidophilus ATCC25923）为对照组，采用平板菌落计数法检测C16LL-37的抗菌活性及其对 S. mutans的靶向性；通过扫描电子显微镜(Scanning electron microscope。SEM)观察C16LL-37作用后S. mutans的细胞形态学变化。
　　结果：1、C16LL-37的最小抗菌浓度(Minimum inhibitory concentration。MIC)为16μM，最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration。MBC)为64μM；2、以浓度为64μM的C16LL-37作用于S. mutans30mins时，细菌存活率为3.46％，60、120mins时细菌存活率为0，其它四种细菌于三个时间点的存活率均大于60%(与S. mutans相比有差异，P＜0.05)；3、利用SEM观察，C16LL-37(32μM)作用后，部分S. mutans出现形态不规则改变、胞膜粗糙、胞浆外溢或细胞裂解现象。
　　结论：本研究合成（标准固相合成法）的特异性靶向抗菌肽C16LL-37对S. mutans具备显著的靶向特异性及较强的抗菌活性；C16LL-37可通过损伤S. mutans细胞膜，使细胞内物质溢出，导致其裂解死亡。