对基因芯片中与淫羊藿苷促进牙周膜干细胞成骨分化相关长链非编码RNA的初步验证

摘要

目的：淫羊藿苷是中国传统中药淫羊藿的有效提取成分，其化学结构和临床效用已明确。中药单体淫羊藿苷已被证实是有效的牙周膜干细胞成骨分化刺激因子。长链非编码RNA（longnon-codingRNA,lncRNA）是非编码RNA（non-codingRNA,ncRNA）中长度大于200个核苷酸的调节性非编码RNA。相关研究表明，由转录因子，染色体调控子和非编码RNA组成的复杂网络存在于多能干细胞中并参与调节再生与多向分化之间的平衡关系。lncRNA在干细胞的增殖和分化过程中起到关键调节作用。通过分析人牙周膜干细胞在淫羊藿苷诱导前后的mRNA及 lncRNA表达谱，筛选出成骨分化相关的lncRNA，并探讨其可能的作用机制。
　　材料和方法：利用流式细胞术鉴定原代人牙周膜干细胞；在此基础上，采用茜素红染色法验证牙周膜干细胞的成骨分化能力；并运用茜素红染色法，验证hPDLSCs在最佳浓度的ICA诱导下的成骨效果；最后，通过基因芯片检测获取人牙周膜干细胞在最佳浓度淫羊藿苷诱导前后的基因表达谱和lncRNA表达谱，筛选表达上调或下调超过2倍的lncRNAs。分析差异性表达lncRNAs的结构、功能及机制，结合芯片结果及文献筛选出有研究价值的2条lncRNAs，生物信息学预测上述lncRNA的靶基因。通过qRT-PCR验证芯片结果。
　　结果：光学显微镜下可见茜素红染色呈现橘红色钙结节；将10-7mol/L淫羊藿苷诱导组合非诱导组的hPDLSC芯片结果比对，选取差异表达倍数2倍以上mRNA和lncRNA构建差异表达谱，发现有117个mRNA和48个lncRNA发生大于2倍的表达变化，mRNA中有78条上调，39条下调，lncRNA中有39条上调，9条下调。利用生物信息学技术筛选出两条怀疑与成骨相关的lncRNA(lnc-COL14A1-1。lnc-USP25-2)并预测其靶基因。qRT-PCR结果验证了差异表达mRNA和lncRNA的表达水平与基因芯片结果一致。
　　结论：经过分析芯片结果及qRT-PCR验证，初步筛选出2个成骨相关lncRNA：lnc-COL14A1-1。lnc-USP25-2，通过构建基因共表达网络，检索以上2个lncRNA所在的子网络所包含的mRNA，预测这2个lncRNA可能参与淫羊藿苷促进牙周膜干细胞成骨分化的过程。

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第一章 前言

第二章 人牙周膜干细胞与淫羊藿苷诱导成骨分化细胞的培养及鉴定

2.1 材料和方法

2.2 统计方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 淫羊藿苷诱导人牙周膜干细胞成骨分化前后差异表达LncRNA的筛选及验证

3.1 材料和方法

3.2 统计方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 淫羊藿苷诱导人牙周膜干细胞成骨分化前后差异表达lncRNA和mRNA的生物信息学分析

4.1 引言

4.2材料和方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 全文总结

参考文献

在学期间研究成果

致谢