人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架的生物相容性

摘要

目的：人羊膜间充质干细胞是否与人脱细胞羊膜支架成功复合。 方法：1）取不同产妇胎盘获取羊膜后，运用去污剂+酶消化法制备人脱细胞羊膜支架，将已制备成功的HAAM行HE染色后于倒置相差显微镜观察HAAM与HAM的形态特征以及细胞移除情况。行免疫荧光染色后于倒置荧光显微镜下进一步观察HAAM移除细胞情况以及细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）损伤情况。 2）同上法获取新鲜羊膜，采用酶联消化法获得hAMSCs。hAMSCs的增殖活性及表型分子分别采用CCK-8法及流式细胞术分析鉴定进行检测。对hAMSCs成骨、成软骨及成脂分化能力予以茜素红、甲苯胺蓝及油红O染色法检测。针对hAMSCs纯度鉴定采用免疫荧光法检测第3代hAMSCs的波形蛋白与CK-19表达情况。 3）将HAAM与第3代hAMSCs共培养，分别在培养14d及21d时应于倒置显微镜以及扫描电镜观察hAMSCs与HAAM复合情况；此外，将第3代hAMSCs进行细胞膜染色后予同样方法与HAAM共培养后于倒置荧光显微镜下观察；制备HAAM浸提液，将hAMSCs分为HAAM组与阴性对照组，分别予以HAAM浸提液与基础培养基培养，运用CCK-8法检测2组hAMSCs在1-7d的增殖活性。 结果：1）去污剂+酶消化法所备至HAAM使用HE染色在倒置显微镜下观察可见正常HAM上皮层完整，基底膜深面有大量hAMSCs细胞核。HAAM上皮层完全脱离， hAMSCs已基本移除，基底膜无明显破坏。免疫荧光染色显示Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原在新鲜人羊膜以及人脱细胞羊膜中均呈阳性表达，DAPI染色可见人脱细胞羊膜呈阴性表达，人羊膜呈阳性表达。 2）酶消化法可提取足量hAMSCs原代细胞，hAMSCs传代培养后，其形态逐渐转变为长梭形，螺旋样贴壁生长。hAMSCs能够表达MSCs表型通过流式细胞学检测鉴定结果证明。镜下可见第3代hAMSCs波形蛋白表达绿色荧光，CK-19无阳性表达。第3代hAMSCs经成骨诱导分化21d，予以茜素红染色，细胞密度增加，可见斑块状褐色物质，部分细胞变成小圆形矿化结节；成脂肪诱导21d，予以油红O染色，细胞排列散乱，细胞形状改变，类圆形细胞中出现脂滴样物质；成软骨诱导21 d，予以甲苯胺蓝染色，可见细胞部分消失，细胞核增大，偏心。 3）将HAAM与第3代hAMSCs共培养，在经过7d的培养过程中，采用CCK-8 assay试剂盒检测细胞的生长、增殖情况，结果显示HAAM浸提液组与普通培养基组细胞均生长良好，在第3-7天时出现细胞增殖水平出现显著差异（P<0.05）。倒置显微镜及扫描电镜示第3代hAMSCs与HAAM共培养14d及21d，倒置荧光显微镜结果显示hAMSCs与HAAM共培养21d后均可见hAMSCs与HAAM黏附良好，广泛分布于HAAM中，hAMSCs排列整齐，呈纺锤形或长梭状。 结论：1) 去污剂+酶消化法备至HAAM可完全清除HAM上的细胞成分，ECM结构无明显破坏。 2）hAMSCs具有向脂肪细胞，软骨细胞与成骨细胞分化的潜能，并且增殖稳定，与普通MSCs的特性类似，可作为备选种子细胞应用于不同组织工程。 3）HAAM能够有效促进hAMSCs黏附，并且未发现排斥反应及毒性。HAAM可以作为负载细胞的载体为组织工程研究提供新型支架。为后期构建组织工程韧带以及促进韧带腱骨愈合奠定前期实验基础。

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