氧化石墨烯对大鼠角膜上皮细胞致损伤作用的初步研究

摘要

石墨烯是目前人们已知的最薄材料，它是由单层的碳原子以sp2杂化轨道组成的蜂窝状二维碳纳米材料，氧化石墨烯作为众多石墨烯衍生物中的一种，也受到相当大的关注。近年来随着石墨烯及其衍生物的大规模生产和应用，它的生物安全问题也备受关注。本实验选用氧化石墨烯作为干扰材料，模式生物为标准体重的 Wistar雌鼠，通过培养大鼠角膜上皮组织，获得原代大鼠角膜上皮细胞；通过MTT法检测正常细胞的细胞活性并进行曲线拟合；当细胞培养至对数生长期，分别加入浓度为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的氧化石墨烯悬浊液与大鼠角膜上皮细胞进行共培养，之后选取适宜浓度的氧化石墨烯干预细胞培养24 h、48 h、72 h，通过MTT法检测不同条件下细胞的活性变化；通过Hoechst33258、HE染色对细胞的外观形态以及核质变化进行观察，观察正常细胞组及干预组细胞的形态变化；流式细胞术检测细胞的凋亡/死亡分布；通过DAPI/PI双染以及台盼兰染色确定正常组和干预组死亡细胞的比例；流式细胞术检测正常细胞组及干预组的细胞周期变化。结果显示：正常的大鼠角膜上皮细胞贴壁后呈翼状分布，密度增大后细胞主要以梭形排列，核质均匀无明显分界；Hoechst33258染色后细胞核呈现圆形或椭圆形，边缘光滑，大小均一；正常细胞曲线呈“S”型，铺板后26 h进入对数生长期，43 h后细胞密度可达到80％；加入氧化石墨烯干预后，细胞延展性降低，形态出现明显皱缩，伪足部分呈现纤维状；染色后发现细胞核的大小差异明显，核边缘部分有类似破损状，核内容物溢出；经流式细胞术检测，正常细胞的比例明显降低，而破损、死亡细胞的数目明显增多；通过DAPI/PI双染以及台盼兰染色，初步推测细胞活性的降低主要由细胞死亡导致而非凋亡引起；HE染色发现，氧化石墨烯能够穿透细胞膜进入细胞并残留，细胞表面也有氧化石墨烯附着；检测细胞周期后，发现氧化石墨烯干预后的角膜上皮细胞会产生S期及G2/M期阻滞，细胞碎片大量增多。
　　以上结果表明：浓度在5μg/mL—100μg/mL范围内的氧化石墨烯对大鼠角膜上皮细胞具有明显的致损伤作用，提示氧化石墨烯对大鼠角膜上皮细胞的生物安全性存在隐患。

目录

声明

第一章 前言

1.1石墨烯

1.2石墨烯及其衍生物的生物学应用

1.3石墨烯及氧化石墨烯的细胞毒性

1.4角膜

1.5细胞周期

1.6细胞周期检验点

第二章 材料和方法

2.1实验材料

2.2主要实验仪器

2.3实验药品

2.4生物学相关数据库和软件

2.5实验试剂

2.6实验方法

第三章 实验结果

3.1 扫描电子显微镜观察GO片层结构

3.2 MTT法绘制正常大鼠角膜上皮细胞的生长曲线

3.3 细胞形态学观察

3.4 MTT法检测细胞经GO干预培养后的活性变化

3.5 细胞死亡率的检测

3.6 细胞周期的测定

第四章 讨论与结论

4.1 讨论

4.2 结论

参考文献

在校期间研究成果

致谢