PM2.5加剧慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能障碍及对免疫炎症反应的影响

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　1、PM2.5加剧慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能障碍机制研究及党参多糖的保护作用
　　目的：本研究拟探讨PM2.5对慢阻肺小鼠AM吞噬功能缺陷的影响，PM2.5造成的肺组织氧化应激水平、肺组织和全身炎症反应水平，并探讨CPP对PM2.5加剧慢阻肺小鼠AM吞噬功能、氧化应激及炎症反应的保护作用及机制。
　　方法：50只SPF级雄性BALB/c小鼠按照随机数字表法分为健康对照组、慢阻肺组、慢阻肺PM2.5组、慢阻肺CPP组、慢阻肺CPP+PM2.5组，每组10只。采用单纯香烟烟雾暴露连续90d建立慢阻肺小鼠模型，所有PM2.5干预组给予PM2.5（770μg/m3）雾化吸入连续90d，所有CPP干预组给予CPP（300mg/kg）灌胃连续90d。造模结束后采用小鼠无创体描箱检测肺功能，吸气峰流速（PIF）和呼气峰流速（PEF）；颈椎脱臼法处死小鼠，经气管生理盐水全肺灌洗获得支气管肺泡灌洗液（BALF），无菌获取肺组织，检查其病理形态学改变，计算肺平均内衬间隔（MLI）；采用不连续密度梯度离心法分离AM，流式细胞术检测AM吞噬荧光素异硫氰酸酯标记的大肠杆菌（FITC-E.coli）的能力，用平均荧光强度（MFI）、吞噬E.coli阳性细胞百分比（吞噬％）表示。分别用菲罗啉比色法、硫代巴比妥酸比色法、改良Hafeman法检测肺组织匀浆总抗氧化物能力（TAC）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）水平。用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法检测BALF和血清中白介素（IL）-6、IL-8、肿瘤坏死因子（TNF）-α水平。
　　结果：1.小鼠肺功能：慢阻肺组PIF和PEF：（7.63±0.94）、（4.43±0.63）显著低于健康对照组组（11.85±1.28）、（7.38±0.82），慢阻肺PM2.5组PIF和PEF：（5.62±0.53）、（3.11±0.41）显著低于慢阻肺组（均P<0.01），慢阻肺CPP组PIF和PEF：（8.79±0.51）、（5.98±0.34）和慢阻肺CPP+PM2.5组PIF和PEF（6.45±0.45）、（3.64±0.39）分别显著高于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组（均P＜0.01）。
　　2.病理学改变：慢阻肺组肺组织有炎症细胞浸润和肺泡腔扩大、肺泡壁破坏等肺气肿改变，MLI比健康对照组显著扩大（55.51±2.17比32.92±1.30）（P<0.01），慢阻肺PM2.5组上述改变较慢阻肺组严重，MLI（61.69±1.84）进一步扩大（P<0.01），慢阻肺CPP组和慢阻肺CPP+PM2.5组则分别较慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组减轻，MLI（43.25±1.50、57.78±1.69）也较各自对照组缩小（P<0.01）。
　　3.AM吞噬功能：慢阻肺组MFI、吞噬%：（4939±924）、（30.90±5.19）%显著低于健康对照组（10222±1567）、（69.11±5.59）%（均P<0.01），慢阻肺PM2.5组MFI、吞噬%：（3293±543）、（20.91±3.51）%显著低于慢阻肺组（均P<0.01），慢阻肺CPP组MFI、吞噬%：（5903±484）、（38.53±2.84）%和慢阻肺CPP+PM2.5组MFI、吞噬%：（4064±418）、（26.88±1.84）%分别显著高于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组（均P<0.01）。
　　结论：1.单纯香烟烟雾暴露法可复制慢阻肺小鼠模型；
　　2.慢阻肺小鼠AM吞噬大肠杆菌能力低下，肺组织处于氧化应激状态，肺组织局部和全身炎症反应增强；
　　3.PM2.5损害慢阻肺小鼠AM的吞噬能力，并加重氧化应激、恶化肺组织局部及全身炎症反应；
　　4.CPP对慢阻肺小鼠和PM2.5干预后的慢阻肺小鼠AM均有保护作用，可改善其吞噬能力、氧化应激状态、肺局部及全身炎症状态。
　　2、PM2.5对慢性阻塞性肺疾病小鼠Th17/Treg失衡及免疫炎症反应的影响
　　目的：本研究探讨PM2.5对慢阻肺小鼠Th17、Treg细胞比例、Th17/Treg比值失衡及相关细胞因子IL-17、IL-10产生的影响及与AM Delta1/4配体表达、脾脏T细胞Notch1受体表达、血清IL-6水平的关系。
　　方法：50只SPF级雄性BALB/c小鼠按照随机数字表法分为正常对照组、慢阻肺组、慢阻肺PM2.5组、慢阻肺GSI（Notch信号通路特异性抑制剂γ分泌酶抑制剂）组、慢阻肺GSI+PM2.5组，每组10只。采用单纯香烟烟雾暴露连续90d建立慢阻肺小鼠模型，所有PM2.5干预组给予PM2.5（770μg/m3）雾化吸入连续90d，所有GSI干预组自造模第61d至第90d隔日给予腹腔注射GSI（1mg/kg）。造模结束后采用小鼠无创体描箱检测肺功能，PIF和PEF；颈椎脱臼法处死小鼠，无菌获取肺组织，检查其病理形态学改变，计算MLI；采用不连续密度梯度离心法分离AM，连续密度梯度离心法、尼龙毛柱法分离提纯脾脏T细胞。流式细胞术检测Th17、Treg细胞占CD4阳性T细胞的百分比并计算Th17/Treg比值，实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测AM上Delta1/4、T细胞Notch1的mRNA表达，免疫印迹法检测Delta1/4、Notch1蛋白表达，ELISA法检测血清中IL-6、IL-17、IL-10水平。
　　结果：1.肺功能及病理学改变：慢阻肺组PIF和PEF（7.63±1.12）、（4.44±0.70）显著低于健康对照组（12.03±1.35）、（7.17±0.63）（P＜0.01）。慢阻肺组出现明显的支气管炎症和肺气肿改变，健康对照组未出现上述改变，慢阻肺组MLI（56.31±3.27）明显比健康对照组（33.32±2.28）扩大（P＜0.01），慢阻肺模型小鼠符合慢阻肺特征性改变。
　　2.Th17亚群比例：慢阻肺组（17.69±5.08）显著高于健康对照组（5.59±1.49），慢阻肺PM2.5组（32.16±6.06）显著高于慢阻肺组（均P<0.01），慢阻肺GSI组（12.11±1.83）和慢阻肺GSI+PM2.5组（27.57±7.38）分别显著第于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组（P<0.05或P<0.01）。
　　Treg亚群比例：慢阻肺组（0.84±0.29）显著低于健康对照组（1.18±0.60），慢阻肺PM2.5组（0.45±0.16）显著低于慢阻肺组（P<0.05），慢阻肺GSI组（1.15±0.25）和慢阻肺GSI+PM2.5组（0.77±0.23）分别显著高于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组（P<0.05或P<0.01）。
　　Th17/Treg比值：慢阻肺组（22.50±7.72）显著高于健康对照组（5.81±3.03），慢阻肺PM2.5组（77.32±22.14）显著高于慢阻肺组（均P<0.01），慢阻肺GSI组（11.07±3.13）和慢阻肺GSI+PM2.5组（38.72±15.04）分别显著低于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组（P<0.05或P<0.01）。
　　3.Delta1、Delta4、Notch1mRNA和蛋白表达：慢阻肺组（6.34±0.88、0.78±0.05）、（10.03±1.32、0.70±0.06）、（11.56±1.39、0.51±0.07）显著高于健康对照组（1.20±0.72、0.54±0.48）、（1.06±0.38、0.51±0.07）、（1.03±0.28、0.29±0.05）（均P<0.01），慢阻肺PM2.5组（9.97±3.38、1.05±0.07）、（19.08±3.40、0.88±0.05）、（23.11±5.98、0.77±0.06）显著高于慢阻肺组（P<0.05或P<0.01），慢阻肺GSI组（2.23±0.56、0.69±0.05）、（7.27±1.27、0.63±0.05）、（7.74±1.01、0.41±0.05）和慢阻肺GSI+PM2.5组（4.00±3.54、0.90±0.10）、（12.66±2.07、0.77±0.06）、（17.05±2.40、0.63±0.06）分别显著低于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组（P<0.05或P<0.01）。
　　结论：1.慢阻肺小鼠存在Th17细胞升高为主的Th17/Treg失衡，导致IL-17水平升高，IL-10水平降低，慢阻肺小鼠存在Th17/Treg细胞失衡导致的炎症反应，PM2.5可加重该免疫炎症反应；
　　2.慢阻肺小鼠AM上Delta1/4、T细胞上Notch1表达均上调，PM2.5可使慢阻肺小鼠Delta1/4-Notch1的表达进一步上调；
　　3.PM2.5干预前后，慢阻肺小鼠Th17细胞升高为主的Th17/Treg失衡及IL-17水平升高的炎症反应状态与Delta1/4、Notch1表达均上调有关，GSI可部分逆转PM2.5干预前后慢阻肺小鼠的免疫炎症反应，与其抑制Delta1/4-Notch1通路活化相关；
　　4.慢阻肺小鼠血清IL-6含量增加，PM2.5加剧IL-6的过度释放，参与调控Th17比例异常升高；AM Delta1/4表达上调与IL-6含量增加有关，推测AM可能参与IL-6的异常释放，导致Th17细胞异常升高，参与PM2.5干预前后慢阻肺的免疫炎症反应。

目录

声明

第一部分 PM2.5加剧慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能障碍机制研究及党参多糖的保护作用

1.1 慢阻肺具有较高的患病率和死亡率

1.2慢阻肺发病的危险因素、病理学改变与病理生理学机制概述

1.3 肺泡巨噬细胞（AM）在慢阻肺发病中居于中心地位

1.4 氧化应激是慢阻肺重要的发病机制之一

1.5 慢阻肺发病中炎症的作用

1.6 PM2.5及其对慢阻肺的影响

1.7 党参多糖（CPP）及其在疾病防控中的作用

第二章材料

2.1 实验动物

2.2 试剂

2.3 仪器

2.4 重要实验试剂配制

第三章方法

3.1 PM2.5的收集与混悬液制备

3.2 实验动物分组及处理

3.3 慢阻肺小鼠模型建立

3.4 AM的分离培养及鉴定

3.5 AM吞噬FITC-E.coli的检测

3.6肺组织匀浆制备及TAC、GSH-PX、MDA的检测

3.7 BALF及血清中IL-6、IL-8、TNF-α的检测

3.8 统计学方法

第四章结果

4.1 兰州市PM2.5的收集结果

4.2 慢阻肺小鼠模型建立

4.3 AM鉴定结果

4.4 各组AM吞噬FITC-E.coli能力的比较

4.5 各组肺组织匀浆TAC、MDA、GSH-PX水平的比较

4.6 各组BALF及血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平的比较

4.7相关性分析结果

第五章讨论

5.1单纯香烟烟雾法可建立慢阻肺小鼠模型

5.2慢阻肺小鼠AM吞噬功能缺陷，PM2.5加重其功能缺陷

5.3 慢阻肺小鼠肺组织存在氧化应激，PM2.5恶化其氧化应激

5.4 慢阻肺小鼠肺局部及全身炎症水平升高，PM2.5进一步加剧炎症状态

5.5 CPP对PM2.5暴露慢阻肺小鼠的保护作用

第六章结论

第二部分 PM2.5对慢性阻塞性肺疾病小鼠Th17/Treg失衡及免疫炎症反应的影响

1.1 免疫失衡在慢阻肺发病中的作用

1.2 Delta1/4-Notch1通路与慢阻肺

1.3 PM2.5对免疫系统的影响及在疾病中的作用

第二章 材 料

2.1实验动物

2.2 试剂

2.3 仪器

2.4主要实验试剂配制

第三章方法

3.1 PM2.5的收集与混悬液制备

3.2 实验动物分组及处理

3.3 慢阻肺小鼠模型建立

3.4 AM的分离培养及鉴定

3.5脾脏T淋巴细胞分离培养及鉴定

3.6 Th17、Treg亚群比例测定及Th17/Treg比值计算

3.7实时荧光定量PCR法检测AM Delta1/4和T细胞Notch1 mRNA

3.8 Western blot法检测AM Delta1/4和T细胞Notch1蛋白

3.9血清AM细胞因子IL-6、Th17细胞因子IL-17、Treg细胞因子IL-10含量测定

3.10统计学方法

第四章结果

4.1兰州市PM2.5的收集结果

4.2慢阻肺小鼠模型建立

4.3 AM鉴定结果

4.4小鼠脾脏T淋巴细胞纯度鉴定

4.5 Th17、Treg亚群比例测定及Th17/Treg比值计算结果

4.6 AM Delta1/4和T细胞Notch1 mRNA表达

4.7 AM Delta1/4和T细胞Notch1蛋白表达

4.8血清AM细胞因子IL-6、Th17细胞因子IL-17、Treg细胞因子IL-10含量测定

4.9相关性分析结果

第五章讨论

5.2 慢阻肺小鼠AM Delta1/4、T细胞Notch1表达均上调，与Th17引发的免疫炎症反应相关

5.3 AM可能参与慢阻肺小鼠IL-6过度释放，过度调控Th17细胞分化

5.4 PM2.5加剧慢阻肺小鼠Th17/Treg失衡引起的免疫炎症反应

第六章结论

参考文献

在学期间的研究成果

缩略语表

致谢