植物半胱氨酸氧化酶和硫化氢在拟南芥低氧胁迫应答反应中的功能及其机制研究

摘要

在动植物细胞中，氧依赖的N末端规则（N-end rule）信号通路介导的N末端半胱氨酸残基的氧化决定某些特异蛋白的稳定性。近期发现，植物半胱氨酸氧化酶PCOs（plant cysteine oxidases）以O2为辅基参与氧化乙烯应答转录因子第七家族ERFVII（ethylene response transcription factor VII）成员的N末端半胱氨酸残基，从而调控它们在植物细胞中的稳定性。该家族蛋白成员在低氧条件下处于稳定状态，故而能够激活植物细胞内低氧分子应答反应信号通路，而在常氧条件下，该蛋白发生降解，低氧应答信号被抑制。在拟南芥中，PCO家族主要由5个成员构成，PCO1和 PCO2作为氧感知器参与感知植物细胞内氧浓度变化，然而，PCO3、PCO4和PCO5的功能目前尚不清楚。另外，气体信号分子H2S（hydrogen sulfide）在动物中作为氧感知器参与调控由低氧诱导引发的相关疾病。但是，H2S在植物低氧应答信号中的作用机制目前仍不完全清楚。本研究以拟南芥野生型Col-0以及PCOs相关的T-DNA插入突变体为材料，通过形态学比较、生理生化检测、生物信息学分析、实时定量qRT-PCR和基因工程等实验技术手段从生理生化、细胞和分子水平研究了PCOs和H2S 在拟南芥氧感知和应答低氧胁迫过程中的分子作用机制。主要研究结果如下： 1. 通过统计拟南芥野生型与 PCOs 相关突变体之间的种子萌发率和种子萌发速率发现，pco1pco2、pco4pco5和pco1pco2pco4pco5的种子萌发速率明显低于野生型和PCOs相关的单突变体，且pco1pco2pco4pco5的种子萌发率只有45%，约为野生型种子萌发率的一半。 2. 通过观察统计野生型与PCOs突变体在正常生长条件下的植株表型、根长、莲座叶数量及叶面积发现，pco1pco2、pco4pco5和pco1pco2pco4pco5的初生根长度显著小于PCOs单突变体和野生型的根长。此外，它们的莲座叶数量减少，叶片变小，尤其是pco1pco2pco4pco5生长发育迟缓，莲座叶数量不及野生型叶片数的50%，叶面积只有野生型叶片的三分之一大小，而且花粉出现败育。PCOs单突变体表型与野生型无明显差异，表明PCOs成员之间可能存在功能冗余。 3. 对不同植物物种间的PCOs进行进化树分析，根据氨基酸序列以及PCOs在转录调控过程中蛋白成员之间的相关性，将PCOs分为两个亚类：一类为低氧诱导表达的PCO1和PCO2（clade I），另一类为非低氧诱导表达的PCO3、PCO4和PCO5（clade II）。 4. 将构建的35S::PCO3-GFP、35S::PCO4-GFP、35S::PCO5-GFP表达载体利用AGROBEST技术手段转入拟南芥幼苗，通过激光共聚焦观察发现，PCO4与PCO5主要定位于细胞质和细胞核内，这与PCO1和PCO2的亚细胞定位结果相一致，而PCO3只定位于细胞质中。 5. 在低氧处理后，GUS 组织化学染色结果显示，PCO3与PCO4在拟南芥中属于组成型表达，而低氧胁迫能够诱导PCO3主要在根伸长区表达，PCO4主要在植物叶片和根原基处大量表达。 6. qRT-PCR检测分析结果显示，PCOs相关缺失突变体在常氧条件下能够诱导低氧应答关键基因的组成性表达，而且在N-end rule相关突变体prt6和ate1ate2中同样能够诱导低氧标志基因表达量上调，表明在拟南芥中，PCOs中的clade II也参与调控低氧应答反应，暗示出clade I和clade II都能够调控植物中N-end rule介导的氧感知机制信号途径。 7.Evans blue与DAB染色显示，拟南芥野生型经外源H2S预处理后，水淹低氧处理3天的拟南芥叶片只有少部分被染为蓝色（Evans blue），且DAB染色也较 H2S 非预处理组浅。此外，通过检测植物的抗氧化能力发现，外源H2S预处理对SOD（superoxide dismutase）活性无显著性影响，但明显提高了水涝低氧胁迫36 h后GSH（glutathione）的含量。与此同时，qRT-PCR显示 H2S 预处理明显降低了常氧与低氧胁迫条件下拟南芥中程序性细胞死亡标志基因PR1（pathogenesis related gene 1）的表达水平，表明外源H2S预处理降低了水淹低氧胁迫后拟南芥细胞内H2O2积累，减轻了植物细胞死亡程度。 8. 通过在荧光显微镜下观察外源H2S预处理和非预处理组拟南芥根尖H2S特异性荧光强度，发现外源H2S处理增强了植物细胞内源H2S的含量，并证明低氧胁迫能够诱导细胞内产生 H2S。同时 qRT-PCR 检测结果显示，H2S预处理后拟南芥中 H2S 合成与分解相关关键基因 DES1 （L-cysteine desulfhydrase 1）、CYS-C1（cyanoalanine synthase-C1）及OASA1 （O-acetylserine(thiol)lyase(OAS-TL)isoform A1）表达量明显升高，有利于维持在常氧或低氧胁迫条件下植物细胞内源 H2S 含量在正常的生理水平范围之内。 9.外源H2S预处理影响了内质网胁迫（ER stress）相关的非折叠蛋白应答反应UPR（unfolded protein response）标志基因ZIP17（basicleucine zipper17）、ZIP28（basic leucine zipper28）、BIP1（binding protein 1）、BIP3（binding protein 3）、TIN1（tunicamycininduced 1）、PDI6（protein disulphide isomerase 6）、ERO1（ER oxidoreductase 1）、CNX1（calnexin 1）和CRT1（calreticulin 1）的表达量变化，表明H2S很可能通过调节植物细胞内蛋白质的正确折叠来提高植物抗水涝低氧胁迫的能力。 综上所述，在拟南芥中，PCOs中的clade I和clade II都参与调控氧依赖的N-end rule相关氧感知机制与低氧应答反应。而且H2S通过影响低氧胁迫条件下蛋白的正确折叠来调控拟南芥的水涝低氧应答反应，最终缓解低氧胁迫对植物细胞造成的死亡。本研究有望未来拓宽研究思路，将N-end rule氧感知机制与H2S的分子作用机制结合，通过探究H2S对N-end rule信号途径的直接或间接调控机理，为农作物改良提供理论依据和实践方案。

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