多管水母的发光系统——绿色荧光蛋白的改造及其初步应用研究

摘要

多管水母的发光系统由光蛋白—多管水母素(aequorin)和绿色荧光蛋白(GFP)组成.GFP作为良好的活体标记,而aequorin作为分子标记及Ca<'2+>的生物学指示剂,已被广泛地应用于生命科学的多个研究领域.迄今所研究的GFP和aequorin主要来源于维多利亚多管发光水母(Aequoreavictoria).该文研究从中国厦门水域的多管水母中获得gfp和aequorin基因,并进行原核、真核表达,系统检测其荧光和其他理化性质,同时通过对gfp基因的定向突变和一定区域的随机突变,获得一些具有独特荧光或理化性质的变异型.

目录

前言

一、发光海洋生物研究概况

二、海洋生物的发光体系

三、多管水母发光系统的研究进展

3.1光蛋白(aequorin)

3.2多管水母的绿色荧光蛋白

四、珊瑚虫的荧光蛋白

五、本研究的目的和意义

材料和方法

结果

一、发光水母的形态

二、aeqxm和aeqxxm基因的分离和理化性质初步研究

2.1aeqxm基因的分离

2.2 aeqxxm基因的分离

2.3 aeqxm、aeqxxm推测的氨基酸序列的分析

2.4 apoaeqxm和apoaeqxxm蛋白在E.coli中的表达

2.5再生时间、NaCl浓度、pH和温度对Aeqxm、Aeqxxm再生的影响

三、GFPxm基因的分离及荧光性质研究

3.1 GFPxm DNA的分离

3.2 GFPxm cDNA的分离

3.3融合GFPxm在大肠杆菌中的表达

3.4非融合GFPxm在大肠杆菌中的表达

3.5 GFPxm的纯化和荧光性质测定

3.6 GFPxm推测的氨基酸序列

四、GFPxm的基因改造

4.1 GFPxm第64-66位氨基酸的定点随机突变

4.2 DNA shuffling突变

4.3采用定点突变技术对GFPxm突变型的66、69和203位氨基酸进行突变

4.4表达温度和时间对GFPxm突变型荧光强度的影响

五、GFPxm突变型在哺乳动物细胞中的表达

讨论

一、Aeqxm和Aeqxxm基因及理化性质

二、大型多管水母绿色荧光蛋白基因的分离及蛋白荧光光谱

三、GFPxm突变型

四、表达温度和表达时间对GFPxm突变型荧光强度的影响

小结

参考文献

科研及成果

附录

致谢