基于绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的双荧光共定位系统

摘要

本发明提供了一种基于绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的双荧光共定位系统。该组用于检测待测蛋白是否相互作用的融合蛋白，为如下1)和2)：1)由荧光蛋白A、待测蛋白A和核输出信号组成；2)由荧光蛋白B、待测蛋白B和核定位信号组成；所述荧光蛋白A与所述荧光蛋白B为发不同颜色荧光的荧光蛋白；所述1)所示融合蛋白片段与2)所示融合蛋白片段分别独立包装；所述待测蛋白A和待测蛋白B是待检测是否相互作用的两个蛋白。本发明方法检测结果可靠，操作简单，一目了然地看到共定位现象，易于判别，方便快捷。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的双荧光共定位系统。

背景技术

研究蛋白质-蛋白质间的相互作用(PPI)是研究细胞中信号通道和传导的基础。细胞内部的动态和平衡态、内部变化和细胞生理功能都很大程度上依赖于蛋白质-蛋白质相互作用的信号网络进行调节。检测他们之间的相互作用，揭示生物学功能是目前生物医药领域的热点之一。

通过分子生物学的方法，调节特定的蛋白质与蛋白质相互作用为一些疑难杂症也提供了一种新的治疗方法的可能性。因此，无论是学术科研机构还是制药公司对这一领域都表现出浓厚的兴趣，希望通过发现和调节蛋白质与蛋白质的相互作用作，为临床治疗找到一种新的治疗手段。

在生物体外有很多种研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法。其中大多需要首先将这些蛋白从其生理环境中纯化出来才可以使用。因为只有将所研究的蛋白还原到自然细胞生理状态下进行研究，我们才能得到准确空间信息，因此能够用于活细胞中生理水平PPI的分析技术显得尤为重要。

类似的技术包括：荧光共振能量转移技术(FRET)、双分子荧光互补技术(BiFC)、荧光互相关谱(FCCS)等。在这些方法中，双色荧光共定位技术是较为普遍的研究蛋白质相互作用的技术之一，并且广泛用于研究各类细胞和生物中。另外，亚细胞定位、多蛋白质分析同样也能够被双色荧光共定位技术检测出来。

绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白RFP蛋白，是自发荧光蛋白中最重要的成员。它们分别是从水母victoria和珊瑚Discosma中分离得到的自发荧光蛋白。它们的光谱范围分别是359nm-509nm和558nm-702nm。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测待测蛋白是否相互作用的融合蛋白组。

本发明所提供的用于检测待测蛋白是否相互作用的融合蛋白组，为如下1)和2)：

1)由荧光蛋白A、待测蛋白A和核输出信号组成的融合蛋白；

2)由荧光蛋白B、待测蛋白B和核定位信号组成的融合蛋白；

所述荧光蛋白A与所述荧光蛋白B为发不同颜色荧光的荧光蛋白；

所述1)所示融合蛋白片段与2)所示融合蛋白片段分别独立包装；

所述待测蛋白A和待测蛋白B是待检测是否相互作用的两个蛋白。

上述融合蛋白组中，所述1)所示融合蛋白中，荧光蛋白A、待测蛋白A和核输出信号顺次连接；

所述2)所示融合蛋白中，待测蛋白B、核定位信号和荧光蛋白B顺次连接。

上述融合蛋白组中，所述荧光蛋白A为红色荧光蛋白或绿色荧光蛋白；所述荧光蛋白B为红色荧光蛋白或绿色荧光蛋白。

上述融合蛋白组中，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述核输出信号的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述核定位信号的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

上述任一所述1)所示融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围；上述任一所述2)所示融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

如下Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围：

Ⅰ、含有上述任一所述1)所示融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒；

Ⅱ、含有上述任一所述2)所示融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒；

Ⅲ、含有上述任一所述1)所示融合蛋白的编码基因和上述任一所述2)所示融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。

上述重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒中，所述Ⅰ中所述重组表达载体为如下a所示；所述Ⅱ中所述重组表达载体为如下b所示；所述Ⅲ中所述转基因细胞系是将a所示重组表达载体和b所示重组表达载体转入细胞得到的；

a、按照如下方法得到的重组表达载体：在载体pmWasabi-C的多克隆位点间插入所述核输出信号的编码基因和待测蛋白A的编码基因，使绿色荧光蛋白的编码基因、待测蛋白A的编码基因和核输出信号的编码基因顺次连接为融合基因；

b、按照如下方法得到的重组表达载体：在载体pDsRed1-N1的多克隆位点间插入所述核定位信号的编码基因和待测蛋白B的编码基因，使待测蛋白B的编码基因、核定位信号的编码基因和红色荧光蛋白的编码基因顺次连接为融合基因。

上述转基因细胞系中，所述宿主细胞为Hela细胞系。

如下物质中的至少一种在检测蛋白是否相互作用中的应用也属于本发明的保护范围：1)上述任一所述的融合蛋白，2)上述编码基因，3)上述Ⅲ所述重组表达载体，4)上述Ⅲ所述重组菌，5)上述Ⅲ所述转基因细胞系。

本发明的最后一个目的是提供一种检测蛋白是否相互作用的方法。

本发明所提供的检测蛋白是否相互作用的方法，包括如下步骤：检测上述Ⅲ所述转基因细胞系的荧光发光情况，根据检测结果判别所述待测蛋白是否相互作用；

所述根据检测结果判别所述待测蛋白是否相互作用的方法如下：

若所述转基因细胞系中细胞核中同时具有两种颜色荧光，则所述待测蛋白相互作用；若所述转基因细胞系中细胞核中具有一种颜色荧光，而细胞质中具有另一个种颜色荧光，则所述待测蛋白不能相互作用。

或者，若所述转基因细胞系中细胞核中同时具有绿色荧光和红色荧光，则所述待测蛋白相互作用；若所述转基因细胞系中细胞核中具有红色荧光，而细胞质中具有绿色荧光，则所述待测蛋白不能相互作用。

所述检测转基因细胞系的荧光发光情况，是在得到所述转基因细胞系后的24h时进行的。

本发明的检测系统，赋予待检测蛋白对在细胞核内和核外分区表达的能力，从而产生空间位移变化的特点，并且使两种蛋白分别带有不同颜色的标记，便于区别。所用的核定位信号是NES数据库中核定位效果最突出的。出核信号的效果也非常明显。当两蛋白相互作用时，两蛋白全部出现在细胞核内，核内同时呈现绿色和红色两种颜色；当两蛋白不存在相互作用时，一个蛋白位于核内呈现红色，另一个蛋白位于核外呈现绿色。通过核内核外的两种颜色的荧光定位变化，就可判断两蛋白是否相互作用(原理示意如图1所示)。此方法检测结果可靠，操作简单，一目了然地看到共定位现象，易于判别，方便快捷。

附图说明

图1为本发明的原理示意图。

图2为pmWasabi-C载体的多克隆位点示意图。

图3为各转染处理组的荧光检测图。

图4为各转染处理组的细胞统计结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

GFP是绿色荧光蛋白，其核苷酸序列SEQ ID NO：2，氨基酸序列SEQ ID NO：1；

RFP是红色荧光蛋白，其核苷酸序列SEQ ID NO：4，氨基酸序列SEQ ID NO：3；

核输出信号(ABL)，其核苷酸序列SEQ ID NO：6，氨基酸序列SEQ ID NO：5；该多肽的作用是帮助核内的某些分子通过核孔进入细胞质。

核定位信号(NoL)，其核苷酸序列SEQ ID NO：8，氨基酸序列SEQ ID NO：7；该多肽的作用是帮助亲核蛋白进入细胞核；

Bcl₂蛋白，其核苷酸序列SEQ ID NO：14，氨基酸序列SEQ ID NO：13；

Bak(+)蛋白，其核苷酸序列SEQ ID NO：10，氨基酸序列SEQ ID NO：9；

TIG₃蛋白，其核苷酸序列SEQ ID NO：12，氨基酸序列SEQ ID NO：11；

已知：Bcl₂蛋白与Bak(+)蛋白能够相互作用而结合；Bcl₂蛋白与TIG3蛋白能够相互作用而结合；

下述实施例中所用的引物如表1所示。

            表1、合成中需要的引物

 Zhou_08c AGCTTAGGTAGCTGGGCAGATT 22

实施例1、

一、GFP系列表达载体的构建

(一)表达融合蛋白GFP-ABL的表达载体的构建

ABL和Bcl2在pmWasabi-C载体中的插入位点如图2所述。

首先，从allelebiotech公司购买pmWasabi-C载体；

其次，退火合成ABL：退火合成的基本过程：

(1)片段处理：50ul：Zhou_05n 10ul，Zhou_06c 10ul，Zhou_07n 10ul，Zhou_08c 10ul(引物浓度0.1nmol/ul)，Ligase buffer(10×)5ul，H₂O 5ul。煮沸5min，冷却至室温。

(2)连接(20ul)：去上述体系10ul，Ligase Buffer 2ul，Ligase 1.5ul，H₂O6.5ul。室温连接2h。

(3)酶切载体pmWasabi-C：载体1ug，EcoRI 0.5ul，HindIII 0.5ul，Buffer2 2ul，H₂O 16ul。37度酶切4h。

(4)胶回收酶切后的载体(步骤参照天跟公司胶回收试剂盒)

(5)连接：将(2)步中连接的片段2ul，酶切后的载体1ul，Ligase Buffer2ul，Ligase 1.5ul，H2O 13.5ul。室温连接2h。

(6)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板。

(7)挑克隆PCR鉴定

(8)取阳性克隆DNA测序

测序结果：载体pmWasabi-C中在EcoRI和HindIII酶切位点间插入的ABL编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，表明得到的基因序列正确及构建的载体正确，将该重组载体记作pmWasabi-ABL；该重组载体pmWasabi-ABL表达GFP-ABL融合蛋白(pmWasabi-C载体中含有GFP蛋白的编码基因，本实验将ABL的编码基因插在GFP的下游，构成了编码GFP-ABL融合蛋白的融合基因)。

(二)表达融合蛋白GFP-Bcl2-ABL的表达载体的构建

PCR扩增得到Bcl2并用XhoI+EcoRI插入到GFP-ABL上面得到GFP-Bcl2-ABL。

如下表达载体GFP-Bcl2-ABL构建步骤：

首先，从allelebiotech公司购买pmWasabi-C载体

其次，(1)PCR扩增Bcl2

模板pmWasabi-C载体1ul

引物09ZJ17n 5’-cgac ctcgagtc atggcgcacgctgggaga-3’                    1ul

引物09ZJ18c 5’-caat gaattc tcacttgtggctcagatagg-3’                    1ul

Pfu mixture(天根公司)                                                   25ul

H2O                                                                     22ul

                                                                                     

                                                                        50ul

反应条件：94度 5min

          94度 40sec

30cycles  60度 40sec

          72度 1min

          4度 10min

(2)酶切(1)PCR产物

PCR扩增产物      40ul

EcoRI            1ul

XhoI             1ul

Buffer 2         5ul

H2O              3ul

                                 

                 50ul

37度酶切4h

(3)酶切载体pmWasabi-ABL

载体      1ulg

EcoRI     0.5ul

Xho I     0.5ul

Buffer 2  2ul

H2O       16ul

                                

          20ul

37度酶切4h

(4)胶回收酶切后的载体(步骤参照天跟公司胶回收试剂盒)

(5)连接

将(2)步中连接的片段    2ul

酶切后的载体           1ul

Ligase Buffer          2ul

Ligase                 1.5ul

H2O            13.5ul

                              

               20ul

室温连接2h

(6)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板。

(7)挑克隆PCR鉴定

(8)取阳性克隆DNA测序

结果：载体pmWasabi-ABL中在EcoRI和Xho I酶切位点间插入的Bcl2编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，表明得到的基因序列正确及构建的载体正确，将该重组载体记作pmWasabi-Bcl2-ABL；该重组载体pmWasabi-Bcl2-ABL表达GFP-Bcl₂-ABL融合蛋白(本实验将Bcl₂的编码基因插在GFP和ABL之间，构成了编码GFP-Bcl₂-ABL融合蛋白的融合基因)。

二、RFP系列表达载体的构建

(一)表达融合蛋白NOL-RFP的表达载体的构建

载体pDsRed1-N1购自Clontech laboratories，产品目录号为Catalog #6921-1；载体pDsRed1-N1中含有RFP的编码基因(DsRed1)。

退火链接NOL

退火合成的基本过程：

(1)片段处理：引物浓度0.1nmol/ul

             Zhou_11n  10ul

             Zhou_12c  10ul

             Zhou_13n  10ul

             Zhou_14c  10ul

             Zhou_15n  10

             Zhou_16c  10ul

             Zhou_17n  10ul

             Zhou_18c  10ul

             Zhou_19n  10ul

             Zhou_20c  10

             Zhou_21n  10ul

             Zhou_22c  10ul

             Zhou_23n  10ul

             Zhou_24c  10ul

             Zhou_25n  10ul

             Zhou_26n  10ul

             Zhou_27c  10ul

             Ligase buffer(10×)20ul

             H2O       10ul

                                              

                       200ul

煮沸5min，冷却至室温

(2)连接：

去上述体系    10ul

Ligase Buffer 2ul

Ligase        1.5ul

H2O           6.5ul

                                              

              20ul

室温连接2h

(3)酶切载体pDsRed1-N1

载体      1ulg

EcoRI     0.5ul

BamHI     0.5ul

Buffer 2  2ul

H2O       16ul

                                   

          20ul

37度酶切4h

(4)胶回收酶切后的载体(步骤参照天跟公司胶回收试剂盒)

(5)连接

将(2)步中连接的片段    2ul

酶切后的载体           1ul

Ligase Buffer          2ul

Ligase                 1.5ul

H2O                    13.5ul

                                          

                       20ul

室温连接2h

(6)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板。

(7)挑克隆PCR鉴定

(8)取阳性克隆DNA测序；

结果：载体pDsRed1-N1中在EcoRI和BamHI酶切位点间插入的NOL编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，表明得到的基因序列正确及构建的载体正确，将该重组载体记作pDsRed1-NOL；该重组载体pDsRed1-NOL表达NOL-RFP融合蛋白(pDsRed1-N1载体中含有RFP蛋白的编码基因，本实验将NOL的编码基因插在RFP的上游，构成了编码NOL-RFP融合蛋白的融合基因)。

(二)表达融合蛋白Bak-NOL-RFP的表达载体的构建

Bak+由引物Venus01n，Venus0退火合成，并用XhoI+HindIII连接到NOL-DsRed的N端。

退火合成的基本过程：

(1)片段处理：引物浓度 0.1nmol/ul

             Venus01n    10ul

             Venus02c    10ul

             Ligase buffer(10×)    3ul

             H2O                    7ul

                                                

                                    30ul

  Venus01  n  5’-TCGAGGGGCAGGTGGGACGGCAGCTCGCCATCATCGGGGACGAC  ATCAACCGAT-3’  Venus02  c  5’-AGCTTTCGGTTGATGTCGTCCCCGATGATGGCGAGCTGCCGTCCC  ACCTGCCC-3’

煮沸5min，冷却至室温

(2)连接：

去上述体系10ul

Ligase Buffer 2ul

Ligase        1.5ul

H2O           6.5ul

                             

              20ul

室温连接2h

(3)酶切载体pDsRed1-NOL

载体        1ulg

XhoI        0.5ul

HindIII     0.5ul

Buffer 2    2ul

H2O         16ul

                                

            20ul

37度酶切4h

(4)胶回收酶切后的载体(步骤参照天跟公司胶回收试剂盒)

(5)连接

将(2)步中连接的片段    2ul

酶切后的载体           1ul

Ligase Buffer          2ul

Ligase                 1.5ul

H2O                    13.5ul

                                         

                       20ul

室温连接2h

(6)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板。

(7)挑克隆PCR鉴定

(8)取阳性克隆DNA测序

结果：载体pDsRed1-NOL中在XhoI和HindIII酶切位点间插入的Bak+编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，表明得到的基因序列正确及构建的载体正确，将该重组载体记作pBak-NOLs-DsRed；该重组载体pBak-NOLs-DsRed表达Bak-NOL-RFP融合蛋白(本实验在pDsRed1-NOL中NOL-RFP的N端插入了Bak的编码基因，构成了编码Bak-NOL-RFP融合蛋白的融合基因)。

(三)表达融合蛋白NOL-RFP-TIG₃的表达载体的构建

人工合成得到SEQ ID NO：12所示的TIG₃基因。

(1)PCR扩增TIG3

模板SEQ ID NO：12所示的TIG₃基因1ul

引物tig3-n-primer 5′-CAAGCTCGAGATGGCTTCGCCACACCAAGA-3′ 1ul

引物tig3-125c-primer5′-CTAGAAGCTTTTAGGACTTGCCATATCTCAGCTGGG-3′ 1ul

Pfu mixture(天根公司)                                            25ul

H2O                                                              22ul

                                                                              

                                                                 50ul

反应条件：94度 5min

          94度 40sec

30cycles  60度 40sec

          72度 1min

          4度  10min

(2)酶切(1)PCR产物

PCR扩增产物       40ul

XhoI              1ul

HindIII           1ul

Buffer 2          5ul

H2O               3ul

                                    

                  50ul

37度酶切4h

(3)酶切载体pDsRed1-NOL

载体      1ulg

XhoI      0.5ul

HindIII   0.5ul

Buffer 2  2ul

H2O       16ul

                              

          20ul

37度酶切4h

(4)胶回收酶切后的载体(步骤参照天跟公司胶回收试剂盒)

(5)连接

将(2)步中连接的片段    2ul

酶切后的载体           1ul

Ligase Buffer          2ul

Ligase                 1.5ul

H2O                    13.5ul

                                      

                       20ul

室温连接2h

(6)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Kan+平板。

(7)挑克隆PCR鉴定

(8)取阳性克隆DNA测序

结果：载体pDsRed1-NOL中在XhoI和HindIII酶切位点间插入的TIG3编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12中第1-375位核苷酸所示，表明得到的基因序列正确及构建的载体正确，将该重组载体记作pTIG3-NOL-DsRed；该重组载体pTIG3-NOL-DsRed表达TIG3-NOL-RFP融合蛋白(本实验在pDsRed1-NOL中NOL-RFP的N端插入了TIG₃的编码基因，构成了编码TIG₃-NOL-RFP融合蛋白的融合基因)。

实施例2、共定位检测

HeLa细胞购自美国模式培养物研究所(简称ATCC)。转染试剂购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司(Vigofect)。

将HeLa细胞于37℃，5％的二氧化碳的加湿孵化器中培养，培养液为含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’Modified Eagle’s medium)。然后将细胞移至24孔组织培养板，当细胞密度达到70％，迅速将各处理组的重组表达载体转染细胞，使用PEI转染试剂。得到转染细胞后，再过24小时检测荧光量。转染量：处理组的重组表达载体分别为300ng。

数据分析方法：使用DMIL荧光显微镜(蔡司，德国)为所有转染细胞进行荧光图像拍摄，每个共转染组分别随机选取300组照片，然后由ImageJ1.42软件进行分析，得出各处理组的共定位细胞数占样本集合的百分比和非共定位细胞数的百分比。然后用orginpro7.5进行显著性差异分析。

各处理组如下：

a、GFP-ABL+NOL-RFP；b、GFP-Bcl₂-ABL+NOL-RFP

c、GFP-ABL+Bak-NOL-RFP Peptide

d、GFP-Bcl₂-ABL+Bak-NOL-RFP Peptide

e、GFP-ABL+TIG₃-NOL-RFP

f、GFP-Bcl₂-ABL+TIG₃-NOL-RFP。

结果如图3和4所示。

a、b、c、e组均是细胞核内呈现红色，细胞质中呈现绿色，即没有出现细胞核内共定位的现象。d和f组全部为细胞核内同时出现红色和绿色且绿色会在核内核仁处聚集，即细胞核内共定位。表明，本发明的检测方法检测结果准确可靠。

序列表

<110>北京大学

 

<120>基于绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的双荧光共定位系统

 

<160>14

 

<210>1

<211>230

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>1

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Thr Thr Met Gly Val Ile Lys Pro Asp

1               5                   10                  15

Met Lys Ile Lys Leu Lys Met Glu Gly Asn Val Asn Gly His Ala Phe

            20                  25                  30

Val Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Asp Gly Thr Asn Thr

        35                  40                  45

Ile Asn Leu Glu Val Lys Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ser Tyr Asp

    50                  55                  60

Ile Leu Thr Thr Ala Phe Ser Tyr Gly Asn Arg Ala Phe Thr Lys Tyr

65                  70                  75                  80

Pro Asp Asp Ile Pro Asn Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr

                85                  90                  95

Ser Trp Glu Arg Thr Met Thr Phe Glu Asp Lys Gly Ile Val Lys Val

            100                 105                 110

Lys Ser Asp Ile Ser Met Glu Glu Asp Ser Phe Ile Tyr Glu Ile His

       115                 120                 125

Leu Lys Gly Glu Asn Phe Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Thr Thr Gly Trp Asp Ala Ser Thr Glu Arg Met Tyr Val Arg Asp Gly

145                 150                 155                 160

Val Leu Lys Gly Asp Val Lys Met Lys Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly

                165                 170                 175

His His Arg Val Asp Phe Lys Thr Ile Tyr Arg Ala Lys Lys Ala Val

            180                 185                 190

Lys Leu Pro Asp Tyr His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Asn

        195                 200                 205

His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val Thr Val Tyr Glu Ile Ala Val Ala

    210                 215                 220

Arg Asn Ser Thr Asp Gly

225                 230

 

<210>2

<211>690

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>2

atggtgagca agggcgagga gaccacaatg ggcgtaatca agcccgacat gaagatcaag      60

ctgaagatgg agggcaacgt gaatggccac gccttcgtga tcgagggcga gggcgagggc     120

aagccctacg acggcaccaa caccatcaac ctggaggtga aggagggagc ccccctgccc     180

ttctcctacg acattctgac caccgcgttc agttacggca acagggcctt caccaagtac     240

cccgacgaca tccccaacta cttcaagcag tccttccccg agggctactc ttgggagcgc     300

accatgacct tcgaggacaa gggcatcgtg aaggtgaagt ccgacatctc catggaggag     360

gactccttca tctacgagat acacctcaag ggcgagaact tcccccccaa cggccccgtg     420

atgcagaagg agaccaccgg ctgggacgcc tccaccgaga ggatgtacgt gcgcgacggc     480

gtgctgaagg gcgacgtcaa gatgaagctg ctgctggagg gcggcggcca ccaccgcgtt     540

gacttcaaga ccatctacag ggccaagaag gcggtgaagc tgcccgacta tcactttgtg     600

gaccaccgca tcgagatcct gaaccacgac aaggactaca acaaggtgac cgtttacgag     660

atcgccgtgg cccgcaactc caccgacggc                                      690

 

<210>3

<211>226

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>3

Met Val Arg Ser Ser Lys Asn Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys

1               5                   10                  15

Val Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly

            20                  25                  30

Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys

        35                  40                  45

Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro

    50                  55                  60

Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile

65                  70                  75                  80

Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg

                85                  90                  95

Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val

        115                 120                 125

Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp

    130                 135                 140

Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly

145                 150                 155                 160

Glu Ile His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val

                165                 170                 175

Glu Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly

            180                 185                 190

Tyr Tyr Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp

        195                 200                 205

Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu

    210                 215                 220

Phe Leu

225

 

<210>4

<211>681

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>4

atggtgcgct cctccaagaa cgtcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag      60

ggcaccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag     120

ggccacaaca ccgtgaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac     180

atcctgtccc cccagttcca gtacggctcc aaggtgtacg tgaagcaccc cgccgacatc     240

cccgactaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc     300

gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg ctgcttcatc     360

tacaaggtga agttcatcgg cgtgaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag     420

accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt gctgaagggc     480

gagatccaca aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga gttcaagtcc     540

atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact actacgtgga ctccaagctg     600

gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc agtacgagcg caccgagggc     660

cgccaccacc tgttcctgta g                                               681

 

<210>5

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>

<400>5

Ala Ile Asn Lys Leu Glu Asn Asn Leu Arg Glu Leu Gln Ile Cys Pro

1               5                   10                  15

Ala Thr

 

<210>6

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>6

gcaatcaaca agctggaaaa caatctccga gaactccaaa tctgcccagc gact            54

 

<210>7

<211>93

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>7

Ser Lys Arg Pro Arg Arg Leu Arg Arg Leu Gly Lys Glu Thr Met Gly

1               5                   10                  15

Arg Ala Cys Arg Ala His Leu Gly Ser His Arg Trp Pro Thr Thr Cys

            20                  25                  30

Thr Thr Lys Thr Thr Thr Thr Arg Ala Arg Arg Arg Lys Arg Arg Arg

        35                  40                  45

Arg Arg Arg Leu Gly Thr Glu Ile Thr Phe Cys Ser Val Met Lys Leu

    50                  55                  60

Ser Leu Met Val Phe Ile Pro Val Lys Val Met Arg Arg Ile Glu Pro

65                  70                  75                  80

His Met Gln Ala Leu Val Thr Gly Leu Gln Gly His Gly

                85                  90

 

<210>8

<211>279

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>8

agcaaacgcc cgcgccgtct gcgccgactg ggcaaagaaa ccatgggccg cgcatgccgc      60

gcgcatctgg gcagccatcg ctggccgacc acatgcacca ccaaaaccac gaccactcgc     120

gcgcgccgcc gaaaacgccg acgtcgccgc cggctgggca ccgaaattac cttttgcagc     180

gtgatgaaac tgagcctgat ggtgtttatt ccggtgaaag tgatgcgccg gattgaaccg     240

catatgcagg cgctggtgac cggcctgcag ggccatggc                            279

 

<210>9

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>9

Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg

1               5                   10                  15

<210>10

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>10

gggcaggtgg gacggcagct cgccatcatc ggggacgaca tcaaccga                   48

<210>11

<211>125

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>11

Met Ala Ser Pro His Gln Glu Pro Lys Pro Gly Asp Leu Ile Glu Ile

1               5                   10                  15

Phe Arg Leu Gly Tyr Glu His Trp Ala Leu Tyr Ile Gly Asp Gly Tyr

            20                  25                  30

Val Ile His Leu Ala Pro Pro Ser Glu Tyr Pro Gly Ala Gly Ser Ser

        35                  40                  45

Ser Val Phe Ser Val Leu Ser Asn Ser Ala Glu Val Lys Arg Glu Arg

    50                  55                  60

Leu Glu Asp Val Val Gly Gly Cys Cys Tyr Arg Val Asn Asn Ser Leu

65                  70                  75                  80

Asp His Glu Tyr Gln Pro Arg Pro Val Glu Val Ile Ile Ser Ser Ala

                85                  90                  95

Lys Glu Met Val Gly Gln Lys Met Lys Tyr Ser Ile Val Ser Arg Asn

            100                 105                 110

Cys Glu His Phe Val Thr Gln Leu Arg Tyr Gly Lys Ser

        115                 120                 125

<210>12

<211>495

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>12

atggcttcgc cacaccaaga gcccaaacct ggagacctga ttgagatttt ccgccttggc      60

tatgagcact gggccctgta tataggagat ggctacgtga tccatctggc tcctccaagt     120

gagtaccccg gggctggctc ctccagtgtc ttctcagtcc tgagcaacag tgcagaggtg     180

aaacgggagc gcctggaaga tgtggtggga ggctgttgct atcgggtcaa caacagcttg     240

gaccatgagt accaaccacg gcccgtggag gtgatcatca gttctgcgaa ggagatggtt     300

ggtcagaaga tgaagtacag tattgtgagc aggaactgtg agcactttgt cacccagctg     360

agatatggca agtcccgctg taaacaggtg gaaaaggcca aggttgaagt cggtgtggcc     420

acggcgcttg gaatcctggt tgttgctgga tgctcttttg cgattaggag ataccaaaaa     480

aaagcgacag cctaa                                                      495

 

<210>13

<211>239

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>13

Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met

1               5                   10                  15

Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala

            20                  25                  30

Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro G1y Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile

        35                  40                  45

Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp

    50                  55                  60

Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala

65                  70                  75                  80

Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr

                85                  90                  95

Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe

            100                 105                 110

Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly

        115                 120                 125

Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp

    130                 135                 140

Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu

145                 150                 155                 160

Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp

                165                 170                 175

Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn

            180                 185                 190

Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro

        195                 200                 205

Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala

    210                 215                 220

Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Ser His Lys

225                 230                 235

 

<210>14

<211>717

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>

 

<400>14

atggcgcacg ctgggagaac ggggtacgat aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat      60

tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg     120

ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc     180

gcatcccgcg acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc     240

gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctgaccct ccgccaggcc     300

ggcgacgact tctcccgccg ctaccgccgc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac     360

ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac     420

ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag     480

agcgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac     540

ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggatgc ctttgtggaa     600

ctgtacggcc ccagcatgcg gcctctgttt gatttctcct ggctgtctct gaagactctg     660

ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggtg cctatctgag ccacaag        717