锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性质及活力调控的研究

摘要

以锯缘青蟹(Scylla serram)内脏为材料，通过含0.2 mol/L NaCl的0.01 mol/LTris-HCl(pH 7.5)缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶柱过滤层析、DE-32离子交换柱层析，获得了比活力为7,990 U/mg的电泳单一纯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂(NAGase，EC 3.2.1.52)。该酶的等电点为4.68，分子量约为132 kD，每个酶蛋白分子含有约1097个氨基酸残基，其中非极性占39.1﹪，碱性占7.1﹪，酸性占24.0﹪，极性不带电荷的占29.8﹪。该酶含两个分子量约为65.8 kD的同型亚基，肽链间不含二硫键而肽链内含有二硫键。该酶为糖蛋白，其中含糖量为12.85﹪(w/w)。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物，测得该酶在0.05 mol/LNaAc-HAc缓冲液(pH 5.8)中催化水解pNP-NAG的最适pH为5.6，最适温度为50℃；该酶在45℃以下，pH 4.6-8.6范围内稳定。pH 5.8下，酶水解pNP-NAG的米氏常数K<,m>为0.424±0.012 mmol/L，最大反应速度V<.max>为17.65±0.32μmol·L<'-1>·min<'-1>，反应的活化能为61.32 KJ/mol。 半胱氨酸的疏基、色氨酸的吲哚基、组氨酸的咪唑基、酸性氨基酸的β-羧基和赖氨酸的ε-氨基是酶的活性功能基团。精氨酸残基、丝氨酸残基不是酶的活性所必需。同时，酶分子链内二硫键的形成不是该酶活性所必需。30℃下酶活性中心解离常数pK<,e>为5.40，解离热焓△H°为7.812kcal/mol，表明与酶活性有关的可解离基团是组氨酸的咪唑基；产物NAG与产物pNP的类似物苯酚、对羟基苯甲酸对酶的抑制作用表明，酶催化底物pNP-NAG水解反应属有序双双机理。在变性剂盐酸胍的作用下，酶分子的活力变化快于构象的变化，说明酶分子的活性中心处于对胍较敏感的区域。 养殖水体中富营养化产生的氨态氮，SP<,3><'->对酶有较强的抑制作用。水体主要有机污染物苯酚对酶有明显的抑制作用，与苯酚相比，邻苯二酚对酶的抑制作用减弱，对苯二酚对酶的抑制作用加强，对羟基苯甲酸的抑制作用最强，这种差异与苯环上基团的性质密切有关。 Cu<'2+>与底物竞争和酶结合产生抑制，Zn<'2+>对酶的抑制为混合型，zn<'2+>使酶活力的变化快于构象的变化，而Cu<'2+>使酶构象的变化快于活力的变化。 养殖水体常用消毒药物中，次氯酸钠、二氯异氰尿酸钠、三氯异氰尿酸、季氨盐、聚维酮碘、过氧化氢对酶的活力有不同程度的影响。同时，次氯酸钠、二氯异氰尿酸钠对酶的抑制作用随着pH值的升高而减弱，而季氨盐、聚维酮碘对酶的抑制作用随着pH值的升高而加强；进一步的活力变化与构象变化比较结果表明，酶活性中心处于对这些消毒药物较敏感的部位，活力损失快于构象的变化。青蟹养殖常用的内服、外用抗菌药物中，磺胺间甲氧嘧啶、氟哌酸、恩诺沙星对酶有明显的抑制作用，而头孢拉定对酶有明显的激活作用。 采用邹氏方法研究了盐酸胍、二甲亚砜、苯酚、过氧化氢、Cu<'2+>、Zn<'2+>等对酶的抑制或失活作用动力学，建立了动力学模型，测定抑制剂与游离酶(E)和酶．底物络合物(ES)结合的微观速度常数，并加于比较，表明抑制剂存在下，底物对酶有明显的保护作用。

目录

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摘要

缩略词

第一章引言

1.1锯缘青蟹简介

1.1.1形态特征与生活习性

1.1.2锯缘青蟹的养殖现状与存在问题

1.1.3锯缘青蟹的研究概况

1.2几丁质酶系的研究概况

1.2.1几丁质与几丁质酶系简介

1.2.2几丁质酶系的研究概况

1.2.3甲壳动物N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的研究情况

1.3本课题的研究内容与研究意义

第二章实验材料、仪器与方法

2.1材料与试剂

2.2仪器

2.3方法

2.3.1蛋白质浓度的测定

2.3.2酶活力测定和比活力的计算

2.3.3酶的分离纯化

2.3.4酶的纯度鉴定

2.3.5酶的理化性质测定

2.3.6酶催化pNP-NAG水解反应的动力学性质研究

2.3.7酶活性中心解离基团性质的研究

2.3.8酶的化学修饰

2.3.9产物与产物类似物对酶的影响

2.3.10变性剂盐酸胍对酶活力与构象的影响

2.3.11金属离子对酶的影响

2.3.12水体氨态氮、亚硝酸盐氮与亚硫酸盐对酶的影响

2.3.13有机物溶剂二甲亚砜与苯酚类物质对酶的影响

2.3.14青蟹养殖常用药物对酶的影响

第三章实验结果

3.1锯缘青蟹NAGase的分离纯化与纯度鉴定

3.2锯缘青蟹NAGase的理化特征

3.2.1酶的分子量

3.2.2酶的等电点

3.2.3酶的亚基数及亚基的分子量

3.2.4酶分子内二硫键的判断结果

3.2.5酶分子中糖含量的测定结果

3.2.6酶的氨基酸组成

3.2.7酶的紫外特征吸收光谱与内源荧光特征光谱

3.3酶催化pNP-NAG水解反应的动力学性质

3.3.1酶催化pNP-NAG水解反应的最适pH及酶的pH稳定性

3.3.2酶催化pNP-NAG水解反应的最适温度及酶的热稳定性

3.3.3酶催化pNP-NAG水解的动力学参数

3.3.4酶催化pNP-NAG水解反应的活化能

3.4酶活性中心解离基团的性质

3.4.1 pH对酶催化pNP-NAG水解反应的效应

3.4.2酶活性中心解离基团的解离常数

3.4.3温度对酶活性中心可解离基团解离常数的影响

3.4.4酶活性中心功能基团的解离热焓

3.5酶的化学修饰

3.5.1 DTT对酶的化学修饰

3.5.2 pCMB对酶的化学修饰

3.5.3组氨酸咪唑基的化学修饰

3.5.4色氨酸残基的化学修饰

3.5.5羧基的化学修饰

3.5.6氨基的化学修饰

3.5.7精氨酸残基的化学修饰

3.5.8丝氨酸残基的化学修饰

3.6产物及产物类似物对酶的影响

3.6.1产物与产物类似物对酶的抑制效应

3.6.2产物与产物类似物对酶的抑制为可逆过程

3.6.3产物与产物类似物对酶的抑制类型

3.7酶经盐酸胍变性后活力与构象变化结果

3.7.1酶经盐酸胍变性后活力变化结果

3.7.2低浓度盐酸胍对酶的作用表现为可逆过程

3.7.3酶经盐酸胍变性后荧光发射光谱变化结果

3.7.4酶经盐酸胍变性后活力变化与构象变化结果比较

3.8酶在盐酸胍溶液中的失活作用动力学

3.8.1酶在盐酸胍溶液中失活动力学模型的建立

3.8.2酶在盐酸胍溶液中的失活速度常数求解方法

3.8.3酶在盐酸胍溶液中的失活微观速度常数测定结果

3.9金属离子对酶的影响

3.9.1 Cu2+对酶的影响与抑制动力学

3.9.2 Zn2+对酶的影响与抑制动力学

3.10水体氨态氮与亚硝酸盐氮对酶的影响

3.11水体SO32-对酶的影响

3.12有机物溶剂二甲亚砜对酶的影响

3.12.1二甲亚砜对酶的抑制作用

3.12.2酶在二甲亚砜溶液中的失活作用研究

3.13苯酚对酶抑制作用的动力学

3.14青蟹养殖常用药物对酶的影响

3.14.1氯制剂类消毒药物对酶活力与构象的影响

3.14.2季铵盐类消毒药物对酶活力的影响

3.14.3碘制剂类消毒药物对酶活力与构象的影响

3.14.4戊二醛对酶活力的影响

3.14.5过氧化氢对酶活力的影响

3.14.6几种抗生素类药物对酶活力的影响

3.14.7几种内服抗菌药物对酶活力的影响

3.14.8恩诺沙星对酶的抑制类型与抑制常数

3.14.9过氧化氢对酶的抑制动力学研究

第四章讨论

4.1酶的分离纯化与理化性质

4.2酶活性中心的功能基团

4.3酶在盐酸胍变性作用下的失活与去折叠

4.4产物对酶的抑制与酶的催化作用机理

4.5金属离子对酶的效应

4.6养殖水体富营养化污染物对酶的影响

4.7苯酚类物质对酶的影响

4.8青蟹养殖常用药物对酶的影响

结论

参考文献

博士研究生期间发表的学术论文

致谢