文昌鱼Pax基因家族的时空表达及VapA/B基因的基因倍增与选择性剪切的进化分析

摘要

文昌鱼作为与脊椎动物亲缘关系最近的类群之一，是进化和发育生物学研究的良好模式动物。本研究首次考察了四个AmphiPax基因在白氏文昌鱼(Branchiostomabelcheri)生活周期中16个发育时期的时间表达模式，以及变态时期4个区域和成体8个组织的空间表达模式。我们发现它们在16个时期都表达，并且在发育时期(尤其在胚胎期和变态期表达水平较高)和器官表达上存在特异性。综合时空表达的模式，我们推测AmphiPax基因的动态特异性表达与相应的器官发育有紧密的联系，并且作为脊椎动物Pax基因的祖先，这些基因不仅在序列上与脊椎动物同源基因有很高的相似性，而且在时空表达模式上也存在相似性：在时间表达模式上，两者不仅在胚胎发育过程中起关键的作用，在成体组织和器官特化过程中也发挥重要作用；在空间表达上，Pax1/9亚家族在鳃、间叶细胞和肠；Pax2/5/8亚家族则在鳃(内柱)、尾和精巢；Pax3/7亚家族在肌肉和肠；而Pax6亚家族在肝和肠都有相似的表达模式。由此，我们讨论了Pax四个亚家族在基因倍增后基因功能的进化。 为了分析基因倍增和选择性剪切的进化机制，我们克隆了文昌鱼Vap(AmphiVapA/B)及其四种不同的选择性剪切体，比较了VapA/B基因家族成员在文昌鱼和人类中选择性剪切的情况，并通过分析发现文昌鱼、人类、河豚和斑马鱼基因组中VapA/B和Spir1/2、RBM12、RAB22A/B等基因保持共线性连锁，证实了从文昌鱼到人类至少发生了一轮倍增，而在河豚和斑马鱼中又发生一轮倍增。同时，我们通过研究AmphiVapA/B四种选择性剪切体在文昌鱼10个发育时期和8个组织的时空表达，发现它们之间存在基因表达的分化，这说明通过这种方式，AmphiVapA/B以此获得了更多的功能。对AmphiVapA/B选择性剪切外显子的蛋白预测发现，选择性剪切外显子2(AS2)中存在卷曲螺旋域。由此，我们提出推测：a．文昌鱼通过选择性剪切体(四种)，人类通过基因倍增和选择性剪切体(共四种)，河豚和斑马鱼通过基因倍增(分别三种)分别达到VapA/B基因功能的多样性。b．在基因倍增的进化中，包含重要结构域的选择性剪切外显子(AS2)在进化过程中成为非选择性剪切的外显子，而次要的选择性剪切外显子，则继续以选择性剪切的方式存在或丢失。c．表达水平更高(发挥更重要功能)的选择性剪切体成为倍增后的个体基因，而较次要的可能以选择性剪切的方式保留或者丢失。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文昌鱼基因家族研究进展

1.利用文昌鱼基因家族进行基因倍增的研究进展

2.文昌鱼AmphiTbx基因家族的基因倍增

3.利用文昌鱼基因家族的功能进化研究

4.Tbxl／lO亚家族成员在脊索动物中的功能进化

5.Pax基因家族的研究进展

6.基因选择性剪切进化的研究进展

7.论文的选题和目的

参考文献

第二章文昌鱼Pax基因家族的时空表达

1材料、试剂和方法

1.1文昌鱼各时期材料的收集

1.2文昌鱼Pax基因家族的系统进化分析

1.3实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)

1.4原位杂交检测基因表达

1.5免疫组化分析

2.结果

2.1总RNA和cDNA一链质量的检测

2.2实时荧光定量PCR引物的设计

2.3 Pax家族系统进化分析

2.4 AmphiPax基因在不同发育阶段的表达模式

2.5 AmphiPax基因在各区域和器官表达模式

3.讨论

3.1 AmphiPax基因在特定的器官发育时被激活

3.2文昌鱼和脊椎动物Pax基因表达模式的比较

4.总结和展望

参考文献

第三章文昌鱼Vap基因的选择性剪切和基因倍增研究

1.材料和方法

1.1材料和cDNA模板

1.2文昌鱼AmphiVapA/B基因及其剪切体的克隆

1.3佛罗里达文昌鱼Vap基因的鉴定

1.4文昌鱼AmphiVapA/B基因片段的系统分析

1.5佛罗里达文昌鱼Vap与人VAPA和VAPB的基因结构比较

1.6佛罗里达文昌鱼Vap与人、河豚和斑马鱼VapA和VapB周围基因连锁分析

2.结果

2.1文昌鱼AmphiVapA/B基因转录的形式

2.2文昌鱼AmphiVapA/B基因的序列

2.3佛罗里达文昌鱼Vap家族基因的鉴定

2.4文昌鱼AmphiVapA/B基因的系统分析

2.5文昌鱼VapA/B与人类VapA的基因比较

2.6文昌鱼VapA与人类VapB的基因比较

2.7 VapA/B基因家族的基因倍增

3.讨论

3.1 Vap家族基因的选择性剪切的进化和基因的多样性

3.2 Vap家族基因的基因倍增

4.总结和展望

参考文献

第四章文昌鱼Vap基因的功能域分析和时空表达

1.材料、试剂和方法

1.1蛋白功能域分析

1.2实时荧光定量PCR

2.结果

2.1蛋白功能域分析结果

2.2Vap四种剪接体实时荧光定量PCR的引物设计

2.3Vap四种剪接体在不同发育时期的表达模式

2.4Vap四种剪接体在不同组织的表达模式

3.讨论

3.1 VapA/B四种选择性剪切体在倍增进化过程中的命运

4.总结和展望

参考文献

结论

硕士期间发表与待发表论文、参加会议

致谢