多环芳烃降解菌的降解特性与降解途径研究

摘要

多环芳烃(PAHs)是一类广泛分布于海洋环境中的典型的持久性有机污染物(POPs)，通过食物链的传递会对生态环境和人体健康造成极大危害。了解PAHs在环境中的来源、分布、归宿及去除问题，已成为当今环境科学研究的前沿课题。生物降解是环境(土壤，沉积物，水体)中PAHs去除的最主要途径。研究其遗传控制方式，探索代谢途径，是为了更好地将降解菌应用于有效而可控的生物修复之中。 本论文将采集自厦门博坦油码头的海水样品，在持续性的高浓度、高分子量PAHs选择压力下进行富集驯化，获得高分子量PAHs的降解混合菌系，并以此讨论高分子量多环芳烃(HMW—PAHs)降解菌的筛选策略；同时对筛选获得的2株能高效降解PAHs的细菌从生理生化角度、基因组学、蛋白质组学方面进行较为系统的研究，探讨其降解特性，解析相关功能基因及功能酶，并在这些基础上推测其代谢途径。获得的主要结果如下： 1．用高浓度(1000 mg/L)，混合PAHs(菲，芘，荧蒽，苯并(a)芘)作为选择压力，从采自石油污染地区样品中驯化获得混合降解菌系，从中分离得到3株可培养单菌，变性梯度凝胶电泳(PCR—DGGE)跟踪分析驯化过程中的细菌群落结构变化及优势菌形成过程。采用高效液相色谱(HPLC)测定混合菌系BL和3株单菌BL01，BL02，BL03对高分子量、难降解的PAH—苯并(a)芘的降解能力，结合DGGE结果分析菌系中各单菌在降解过程中的作用。结果显示BL02，BL03不具有降解BaP的能力，BL0114 d后降解了20.98％，三菌混合培养物降解了22.61％；而混合菌系BL14天后降解了44.07％的BaP，这在同类报道中处于较高水平，显示了BL对BaP有较好的降解能力。该筛选策略有助于关注那些未可培养细菌在HMW—PAHs降解中的作用，因此采用高浓度、高分子量PAHs的选择压力筛选HMW—PAHs的降解菌是一种快速而行之有效的筛选策略。 2．对采自厦门海域的水样和沉积物样品，经过一定时间的PAHs富集培养之后，采用改良的平板升华法成功地筛选到两株菲高效降解菌，降解能力测定显示，它们都能以菲和荧蒽作为唯一碳源生长，72 h后均能完全降解起始浓度为100mg/L的菲。16S rDNA鉴定结果显示这两株分别为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp．B2—7和分支杆菌Mycobacterium sp．S8。 3．通过降解菌对芳香烃化合物和PAHs降解过程中常见中间产物的利用情况，菌株B2—7能利用水杨酸，2—萘酚，邻苯二酚，初步推测它以水杨酸途径代谢菲，菌株S8不能降解萘，能利用原儿茶酸，但是不能利用邻苯二甲酸，很可能是以邻苯二甲酸以外的途径代谢菲。降解菌降解荧蒽的优化条件实验结果显示，非离子表面活性剂Tween—80和营养物葡萄糖能促进菌株B2—7和S8对荧蒽的降解。 4．芳环羟基化双加氧酶和芳环断裂双加氧酶是PAHs降解过程中开环的两种关键酶，其中环羟基化双加氧酶(RHDs)控制苯环加氧，是微生物降解反应的限速步骤，邻苯二酚双加氧酶是催化苯环开裂的重要酶。我们通过引物设计的方法，从降解菌Sphingomonas sp．B2—7中扩增得到全长的邻苯二酚-2，3—双加氧酶基因(C23O)和环羟基化双加氧酶大亚基(phnA)，从分子生物学角度证明了PAHs降解过程中的重要酶系邻苯二酚-2，3—双加氧酶(C23O)和环羟化双加氧酶基因α亚基(phnA)在菌株B2—7中的存在。对phnA基因构建了重组表达载体，成功在表达宿主大肠杆菌E．coli BL21(DE3)中进行表达，基因在宿主中以溶解蛋白形式存在。可以进一步推断菌株B2—7降解菲的基本途径是RHDs氧化PAHs形成二氢二醇PAHs化合物，再在C23O的作用下经由水杨酸途径间位裂解(meta—cleavage)苯环，生成2—羟基粘康酸半醛(2─HMS)。 5．采用1—DE(一向凝胶电泳)和2—DE(双向凝胶电泳)结合LC—MS/MS(串联质谱)，研究菌株B2—7在菲诱导与无菲诱导(对照)状况下的蛋白质表达，对差异蛋白的生物质谱结果进行分析，得到多个代谢途径中的关键酶(加氧酶、脱氢酶、醛缩酶等)，结合菌株B2—7的降解特性与降解基因的研究结果，最终推导出菌株B2—7降解菲较为完整的代谢途径。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1 PAHs的危害及在环境中的分布

1.1 PAHs的危害

1.2环境中的PAHs

2 PAHs污染环境的生物修复

2.1降解PAHs的微生物

2.2影响微生物修复PAHs污染的因子

2.3高分子量PAHs的生物降解

3 PAHs降解的分子生态学研究

3.1降解菌多态性分析方法

3.2微生物群落结构分析方法

4 PAHs降解的分子生物学水平研究

4.1 PAHs降解的基因组学研究

4.2 PAHs降解的代谢组学研究

4.3 PAHs降解的蛋白质组学研究

5本论文的研究内容及意义

参考文献

第二章PAHs降解菌的筛选

1材料和方法

1.1样品来源

1.2主要材料

1.3基本方法

1.4系统发育树的构建

2结果

2.1改良平板升华法筛选菲降解菌

2.2高分子量PAHs混合菌系的筛选

3讨论

3.1 PAHs降解菌的富集培养与筛选

3.2降解PAHs的细菌

4小结

参考文献

第三章混合菌对高分子量PAHs的降解研究

1材料和方法

1.1样品来源

1.2主要材料

1.3基本方法

1.4系统发育树的构建

2.结果

2.1高浓度、高分子量PAHs胁迫下BL混合菌系群落结构变化

2.2 DGGE条带分子鉴定

2.3混合菌BL对苯并[a]芘的降解能力测定

2.4菌株BL01，BL02，BL03的降解谱分析

3讨论

3.1混合菌系对HMW-PAHs的降解

3.2微生物对环境污染物的响应

4.小结

参考文献

第四章PAHs降解菌的降解特性研究

1材料与方法

1.1菌株

1.2主要材料

1.3基本方法

2结果

2.1生理生化特征

2.2对菲、荧蒽的降解能力测定

2.3菌株B2-7和S8降解芳香烃化合物的降解谱

2.4菌株B2-7和S8降解荧蒽的条件优化

3讨论

3.1 PAHs降解菌

3.2微生物降解HMW-PAHs的条件优化

4小结

参考文献

第五章降解机制研究——降解菌关键酶基因的克隆、表达和进化分析

1材料与方法

1.1实验菌株

1.2主要材料

1.3基本方法

2结果

2.1底物利用的降解途径推测

2.2邻苯二酚2，3-双加氧酶(C23O)基因的获得

2.3环羟化双加氧酶基因(phnA)的克隆与表达

2.4基因序列的提交

3讨论

3.1细菌代谢菲的途径

3.2细菌代谢PAHs的重要酶系

4小结

参考文献

第六章降解机制研究——降解菌的蛋白质组学分析

1材料与方法

1.1实验菌株

1.2主要材料

1.3基本方法

2结果

2.1菲诱导的菌株B2-7菌体全蛋白SDS-PAGE电泳

2.2双向电泳研究菲诱导表达蛋白

2.3蛋白质的鉴定

3讨论

3.1细菌全蛋白提取方法

3.2与PAHs代谢相关的蛋白质鉴定

3.3菌株B2-7降解菲的代谢途径

4小结

参考文献

第七章结论与展望

1结论

2本论文创新点

3展望

附 录

致谢