一株鞘氨醇单胞菌对多环芳烃的降解特性及菲降解途径研究

摘要

多环芳烃是一类在环境中有广泛分布的有机化学污染物，具有“三致”性(致畸、致突变、致癌)，通过食物链的传递会对生态环境和人体健康造成极大危害。微生物修复是消除PAHs污染的有效方式。研究降解菌的遗传控制、探索代谢途径、解析相关酶系和功能基因，从而构建基因工程菌株用于污染环境的生物修复是当前研究的热点。 本论文对一株筛选自厦门博坦油码头表层海水的高效菲降解细菌Sphingomonas sp．H的生理生化特征、对PAHs的降解特性、降解条件、降解关键酶基因、差异表达蛋白质组等方面进行了较为系统的研究，获得的主要结果如下： 1．降解能力测定显示，鞘氨醇单胞菌H能以菲和荧蒽作为唯一碳源生长，并能利用PAHs代谢途径中的中间产物，包括2—萘酚、水杨酸、邻苯二酚、苯酚和原儿茶酸。利用均匀设计对鞘氨醇单胞菌H降解菲的条件进行优化，DPS软件数据处理系统分析表明在接种量OD600为0.5，菲起始浓度为498.467 mgL-1，降解时间为47.099 h时，降解速率最大为8.104 mgL-1h-1，降解率可达76.6％。 2．通过引物设计的方法，从鞘氨醇单胞菌H中扩增得到全长的邻苯二酚-2，3-双加氧酶基因(C23O)，从分子生物学角度证明了PAHs降解过程中的重要酶系邻苯二酚-2，3-双加氧酶(C23O)在鞘氨醇单胞菌H中的存在。对C23O基因构建了重组表达载体，成功在表达宿主大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行表达，基因在宿主中以溶解蛋白和包涵体形式同时存在。可以进一步推断鞘氨醇单胞菌H降解菲的基本途径是在C23O的作用下经由水杨酸途径间位裂解(meta-cleavage)苯环，生成2-羟基粘康酸半醛(2-HMS)，从而降解菲。 3．采用2-DE(双向凝胶电泳)结合LC-MS/MS(串联质谱)，研究鞘氨醇单胞菌H在菲诱导与无菲诱导(对照)状况下的蛋白质表达．对差异蛋白的生物质谱结果进行分析，得到多个代谢途径中的关键酶(加氧酶、脱氢酶、醛缩酶等)，结合鞘氨醇单胞菌H的降解特性与降解基因的研究结果，最终推导出鞘氨醇单胞菌H降解菲较为完整的代谢途径。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1多环芳烃的来源与危害

1.1多环芳烃的来源

1.2多环芳烃的危害

2多环芳烃污染环境的生物修复

2.1降解PAHs的微生物

2.2影响微生物修复PAHs的因子

3菲的微生物降解及相关的降解途径

3.1降解菲的微生物

3.2细菌对菲的降解途径研究

4多环芳烃降解途径的研究方法

4.1化学分析方法

4.2基因组学研究方法

4.3蛋白质组学方法在多环芳烃生物降解代谢途径研究中的应用

5本论文的研究内容及意义

第二章材料与方法

1材料

1.1降解菌株

1.2菌体和质粒

1.3主要试剂

1.4主要仪器

1.5 PCR引物

1.6主要培养基

1.7溶液配制

2基本方法

2.1鞘氨醇单胞菌H对PAHs的降解特性及降解条件优化

2 2降解菌基因文库的构建

2.3降解关键酶基因的克隆与表达

2.4鞘氨醇单胞菌H的蛋白质组学实验

第三章结果与分析

第一节鞘氨醇单胞菌H对PAHs的降解特性及降解条件优化

1鞘氨醇单胞菌H的分子鉴定

2鞘氨醇单胞菌H的生理生化特性

3鞘氨醇单胞菌H对不同PAHs的降解

4降解菌对菲降解条件的优化

第二节鞘氨醇单胞菌H基因文库的构建及降解关键酶基因的克隆与表达

1基因组(3.10 kb)文库构建

2鞘氨醇单胞菌H降解关键酶基因的克隆与表达

第三节运用双向电泳技术追踪鞘氨醇单胞菌H降解PAHs过程中的差异表达蛋白

1降解过程中菌体蛋白提取方法的优化

2菲诱导下鞘氨醇单胞菌H的蛋白表达

3 LC-MS／MS分析

4与菲代谢相关的蛋白质鉴定

5鞘氨醇单胞菌H降解菲的代谢途径推测

第四章讨论

1.均匀设计在降解菌对多环芳烃降解条件优化上的应用

2.降解关键酶基因的克隆、表达与同源性分析

3.细菌全蛋白提取方法

4.鞘氨醇单胞菌H降解菲的降解途径推测

4.1鞘氨醇单胞菌H对PAHs降解过程中的中间代谢产物的利用

4.2C230基因的克隆

4.3差异表达蛋白组学的研究

第五章结论与展望

1.结论

2.本论文创新点

3.展望

参考文献

附录

致 谢